牦牛是青藏高原及毗邻地区集役、肉、奶、皮、绒等为一体的特有畜种,是牧民生产和生活资料的主要来源,由于特殊自然环境的限制,牦牛生产性能及繁殖性能普遍较低。探索利用体外胚胎生产技术和体细胞核移植技术等现代生物技术应用于牦牛,提高优秀牦牛个体的扩繁速度,降低繁育成本,保存优良牦牛遗传资源,为牦牛的选育改良提供技术支持。本研究优化牦牛体外受精和体细胞核移植胚胎的培养体系;利用RNA-seq技术筛选牦牛体外受精囊胚和体细胞核移植囊胚差异表达基因,并探讨组蛋白甲基转移酶抑制剂通过促进核重编程提高牦牛克隆效率的方法及氟化钠对牛附植前胚胎发育和凋亡的影响。主要研究内容和结果如下:1.优化了牦牛体外受精、体细胞核移植体系(1)A级COCs体外成熟培养24 h,COCs成熟率、卵裂率和囊胚率显著高于B级和C级COCs;用Percoll液梯度离心分离精子法和BO液上浮法分离牦牛精子,用含3 mg/m L BSA和2.5 mM Theophylline的BO受精液中精子密度在1-5×106﹒mL-1范围受精效果良好;受精卵用TCM 199+卵丘细胞或TCM199+输卵管上皮细胞的共培养体系效果显著高于G1/G2液和SOF液培养体系。(2)用于体细胞核移植的牦牛卵母细胞体外成熟培养20 h后去核,耳源成纤维细胞作为供体细胞传代次数为6代以内,血清饥饿2 d进行核移植;重构胚电融合参数为1.4-1.6 kv/cm、两次脉冲,脉冲时长20μs,脉冲间隔10μs;离子霉素联合6-DMAP进行激活4 h后使用G1/G2胚胎培养液进行培养。2.利用RNA-seq技术挖掘牦牛IVF和SCNT囊胚的差异表达基因(1)IVF-Blastocyst文库和SCNT-Blastocyst文库进行单细胞测序,分别获得52,365,530和52,365,908 raw reads,过滤后分别得到48,810,404(93.21%)和49,328,624(94.20%)clean reads;与牦牛基因组的比对率分别为74.18%和74.54%,其中Unique match比对率分别为64.88%和64.66%。clean reads与牦牛已知基因的比对率分别为52.36%和51.00%,其中Unique match的比对率分别为47.17%和45.25%。(2)通过比对,共有14,352个基因,其中12,395个基因共表达,837和1,120个基因分别特异性表达于ivf-blastocyst和scnt-blastocyst中。采用fdr≤0.001和abs(log2(y/x))≥1的标准共筛选出576个差异表达基因,其中342个基因高表达于scnt-blastocyst,234个基因低表达于ivf-blastocyst。(3)go富集显示,576个差异表达基因被富集于150个cellularcomponentgo项目、218个molecularfunctiongo项目和1042个biologicalprocessgo项目中;显著性分析,有4个cellularcomponentgo项目和2个biologicalprocessgo项目显著富集。经注释后表明差异基因主要参与调节胞外区(go:0044421和go:0005576)、脂蛋白复合物(go:0032994和go:0034358)以及炎症和创伤反应(go:0006954和go:0009611)。(4)kegg通路分析576个差异表达基因参与218条通路,主要包括代谢通路、癌症中的转录失调、类固醇激素生物合成、神经营养因子信号通路、补体与凝血级联和细胞粘附分子。经显著分析发现,其中仅戊糖、葡萄糖醛酸转换(ko00040)达到显著水平(qvalue<0.05)。(5)随机选取20个差异表达基因进行荧光定量pcr验证,结果显示egr1、cpeb1、fgfr2、slc2a4基因在scnt组中的表达量显著上调,hspb1、wnt2b、loc102279723、cdca7l、polr2a、crabp1、kifc3、cdc25a、ddit3、sdc1、loc102282421基因在ivf组中的表达量显著上调,且与rna-seq数据基本一致。(6)ivf-blastocyst和scnt-blastocyst分别预测出1,435和1,499个新转录本,通过编码潜能预测发现分别有23.62%和22.28%的转录本被预测出具有编码潜能。3.组蛋白甲基化转移酶抑制剂对牦牛scnt胚胎发育的影响(1)低剂量gsk126(10μm和20μm)处理牦牛成纤维细胞形态和细胞活力未发生明显变化,高剂量(40μm和80μm)处理组细胞质中出现黑点,活力下降,g0/g1期比例增加、s期和g2/m期比例明显降低,凋亡细胞数增加并影响到细胞增殖和代谢。(2)gsk126处理牦牛成纤维细胞后核移植,发现低剂量组核重构胚囊胚的发育率、te细胞数和icm细胞数显著高于高剂量处理组;而囊胚中凋亡细胞数显著低于高剂量组。依据细胞活力、囊胚发育率、囊胚发育质量综合评价20μmgsk126处理牦牛成纤维细胞24h的作为供体细胞进行核移植效果最佳。(3)分析IVF囊胚、SCNT囊胚和20μM GSK126处理的SCNT囊胚中组蛋白甲基化水平,发现GSK126处理后能降低核移植囊胚中H3K27me2和H3K27me3组蛋白甲基化水平,而对H3K4me2组蛋白甲基化水平没有显著影响。(4)分析胚胎凋亡和发育相关基因,发现GSK126处理后囊胚中凋亡基因BCL-2mRNA表达水平下降,Caspase-9 mRNA表达水平上升,同时能上调胚胎发育基因NANOG、OCT4和GATA3基因mRNA的表达水平。4.NaF对附植前胚胎发育和凋亡的影响(1)NaF处理卵母细胞后,呈剂量依赖性显著抑制卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚发育率;高剂量的NaF处理后卵母细胞内ROS含量显著增加并抑制卵母细胞内T-AOC、GSH-Px、CAT和GSH活性从而诱导卵母细胞氧化应激。(2)随Na F剂量的增加,卵母细胞中Caspase-3和Caspase-9活性显著增加;凋亡基因Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表达水平升高,抗凋亡基因Bcl-2mRNA表达水平降低;同时,卵母细胞内凋亡蛋白Bax表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平则随之下降。(3)NaF处理卵母细胞后体外受精,囊胚总细胞数和滋养层细胞数以及内细胞团数量随NaF剂量的增加而显著减少,囊胚细胞内凋亡细胞数随之增加;胚胎发育相关基因Oct4、Nanog、Sox2和Cdx2的mRNA表达水平随着NaF剂量的增加而显著降低。