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蝉花(Cordyceps bassiana)是中国的传统名贵药材和食材,又名蝉蛹草、蝉茸、胡蝉、蜩等,与冬虫夏草同属虫草属。蝉花中核苷类物质含量丰富,具有多种药用价值,在自然界中对生长环境要求严格,因此未能得到大量研究和开发,国外对蝉花的研究更是稀少。本文利用高纯度的蝉花孢子粉深入开展其核苷类活性成份(特别是腺苷)对模式动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和大鼠嗜铬瘤细胞PC-12细胞在氧化应激条件下的保护作用研究。研究结果如下:
一、孢子粉活性物质鉴定及其对线虫的影响观察
鉴定了蝉花孢子粉活性物质(C.bassiana spore powder,BC-CBSP)提取物中的核苷成分,并探究了提取物对秀丽隐杆线虫的影响。结果显示不同浓度的孢子粉提取物都能延长线虫的寿命,在0.145mg/mL-14.5mg/mL的实验浓度范围内,提取物浓度越高,线虫的寿命越长。提取物对线虫的繁殖能力有一定的抑制作用,其中低浓度提取物延缓了线虫产卵而不影响总产卵数,中高浓度的提取物则略微降低产卵量。高浓度的提取物抑制线虫的运动能力。
二、线虫氧化应激模型的建立及腺苷预处理的保护效果评估
利用百草枯(Paraquat,PQ)处理线虫构建了急性氧化应激模型,通过时间—剂量—死亡率模型(TDM)分析发现,150mM的PQ处理使得线虫在3小时的存活率为50%。在此基础上,通过不同浓度的腺苷与线虫急性氧化应激模型互作结果发现,中高浓度的腺苷能显著提升PQ处理后线虫的存活率,其中3000μM的腺苷对急性氧化应激的线虫具有最高的保护作用。
三、腺苷保护氧化应激条件下的线虫的转录组分析
对未处理线虫、仅用腺苷处理的线虫、处于氧化应激和处于腺苷保护下的线虫CK、AD、PQ、PQ_AD进行了转录组测序分析,以秀丽隐杆线虫已有的转录组信息为参考,筛选各比较组的差异表达基因,并重点分析了CK vs PQ和PQ vs PQ_AD之间的表达差异。CK vs PQ、PQ vs PQ_AD两组对比中大部分差异基因的表达量相反,对两组对比的共同差异基因进行GO分析发现G-protein coupled receptor signaling pathway G蛋白偶联受体信号通路、Signaling信号、Extracellular region胞外区、Cell communication细胞通讯、Signal transduction信号转导等几个GO Term在腺苷对线虫的保护作用中起关键作用。进一步的分析发现包括flp、nlp、npr等在内的神经肽基因家族与腺苷的保护作用有重要联系。
四、PC-12细胞模型下的腺苷保护作用观察
通过PC-12细胞的氧化应激模型进一步评价腺苷的保护作用。在PQ浓度为850mM时,PC-12细胞24h存活率接近50%。24h的腺苷预处理能对PC-12细胞产生保护作用,30μM的腺苷具有最佳的保护效果。腺苷保护作用的受体机制探究结果显示,A2AR在对PQ损伤的保护作用中不起主要作用。线粒体膜电位ΔΨ会在PQ损伤的细胞中降低(P<0.001),细胞ROS在损伤细胞中会升高(P<0.01),但它们在腺苷保护下的细胞中并不会恢复(P>0.05)。
一、孢子粉活性物质鉴定及其对线虫的影响观察
鉴定了蝉花孢子粉活性物质(C.bassiana spore powder,BC-CBSP)提取物中的核苷成分,并探究了提取物对秀丽隐杆线虫的影响。结果显示不同浓度的孢子粉提取物都能延长线虫的寿命,在0.145mg/mL-14.5mg/mL的实验浓度范围内,提取物浓度越高,线虫的寿命越长。提取物对线虫的繁殖能力有一定的抑制作用,其中低浓度提取物延缓了线虫产卵而不影响总产卵数,中高浓度的提取物则略微降低产卵量。高浓度的提取物抑制线虫的运动能力。
二、线虫氧化应激模型的建立及腺苷预处理的保护效果评估
利用百草枯(Paraquat,PQ)处理线虫构建了急性氧化应激模型,通过时间—剂量—死亡率模型(TDM)分析发现,150mM的PQ处理使得线虫在3小时的存活率为50%。在此基础上,通过不同浓度的腺苷与线虫急性氧化应激模型互作结果发现,中高浓度的腺苷能显著提升PQ处理后线虫的存活率,其中3000μM的腺苷对急性氧化应激的线虫具有最高的保护作用。
三、腺苷保护氧化应激条件下的线虫的转录组分析
对未处理线虫、仅用腺苷处理的线虫、处于氧化应激和处于腺苷保护下的线虫CK、AD、PQ、PQ_AD进行了转录组测序分析,以秀丽隐杆线虫已有的转录组信息为参考,筛选各比较组的差异表达基因,并重点分析了CK vs PQ和PQ vs PQ_AD之间的表达差异。CK vs PQ、PQ vs PQ_AD两组对比中大部分差异基因的表达量相反,对两组对比的共同差异基因进行GO分析发现G-protein coupled receptor signaling pathway G蛋白偶联受体信号通路、Signaling信号、Extracellular region胞外区、Cell communication细胞通讯、Signal transduction信号转导等几个GO Term在腺苷对线虫的保护作用中起关键作用。进一步的分析发现包括flp、nlp、npr等在内的神经肽基因家族与腺苷的保护作用有重要联系。
四、PC-12细胞模型下的腺苷保护作用观察
通过PC-12细胞的氧化应激模型进一步评价腺苷的保护作用。在PQ浓度为850mM时,PC-12细胞24h存活率接近50%。24h的腺苷预处理能对PC-12细胞产生保护作用,30μM的腺苷具有最佳的保护效果。腺苷保护作用的受体机制探究结果显示,A2AR在对PQ损伤的保护作用中不起主要作用。线粒体膜电位ΔΨ会在PQ损伤的细胞中降低(P<0.001),细胞ROS在损伤细胞中会升高(P<0.01),但它们在腺苷保护下的细胞中并不会恢复(P>0.05)。