褐飞虱（Nilaparvata lugens，St?l）是中国和东南亚水稻的主要害虫之一，其爆发时会造成重大经济损失。Proclotting enzyme3（PCE3）是一种带Clip结构的丝氨酸蛋白酶，褐飞虱卵巢转录组测序发现PCE3在卵巢小管上皮栓有特异性表达，而生殖发育对褐飞虱繁殖后代尤为关键，因此深入研究PCE3对于理解褐飞虱生殖生理和褐飞虱防治将有重要意义。本研究克隆了NlPCE3（Nilaparvata lugens Proclotting enzyme3）基因，对其时空表达模式进行了分析，并用RNA干扰技术揭示了该基因在褐飞虱中的功能。同时，构建了酵母双杂交文库和pGBKT7-NlPCE3-Y2H gold重组菌株，为深入研究NlPCE3互作蛋白打下基础。主要结果如下：
　　（1）NlPCE3基因的克隆、序列分析及时空表达分析。NlPCE3的ORF编码460个氨基酸，预测分子量为52.2kDa。NlPCE3无跨膜结构域，其N端包含一个20个氨基酸残基构成的信号肽，包含Clip和丝氨酸蛋白酶两个保守结构域。与其他昆虫的Clip丝氨酸蛋白酶比较后发现，仅Clip和丝氨酸蛋白酶这两个保守结构域的同源性较高。NlPCE3与褐飞虱的其余四个PCE同源性较低。荧光定量PCR结果表明，NlPCE3在褐飞虱各个发育时期都有所表达，若虫中表达较低，成虫中表达较高，并且雄虫中的表达尤为高。NlPCE3在褐飞虱成虫的肠道、脂肪体、卵巢和精巢中都有表达。
　　（2）RNA干扰NlPCE3对雌虫和雄虫的影响。dsNlPCE3注射雌虫后，褐飞虱的产卵量急剧减少。进一步研究发现，大量卵滞留在褐飞虱卵巢内，且形状不是正常的香蕉型，而是梨形或球形。NlPCE3干扰后，滤泡细胞中NlPCE3的表达受到抑制，细胞之间的界限不清，这导致卵泡发育异常，卵壳形成异常，排卵受阻。RNA干扰雄虫表明，dsNlPCE3注射雄虫会使与其交配的雌虫产卵量有所变化，影响卵的孵化。解剖干扰后的褐飞虱雄虫发现，其输精管变细，而交配的雌虫体内的受精囊和交尾囊内都有大量精子，这说明RNA干扰不影响精子从雄虫传递到雌虫，但可能影响精子的质量或影响精子受精过程。
　　（3）酵母双杂交文库的构建和pGBKT7-NlPCE3-Y2H gold重组菌株的构建。从褐飞虱总RNA中分离得到总mRNA，通过BP重组和LR重组得到cDNA次级文库，其总克隆数目为1.36E7CFU；随后转化到酵母Y187，滴度为6.0E7cells/mL，成功构建酵母双杂交文库。以pGBKT7为载体，将NlPCE3的ORF序列用两步连接法构建pGBKT7-NlPCE3载体，转化到Y2H gold酵母菌株，并基于Myc抗原标签进行了Western blot验证。自激活和毒性实验表明该重组菌株不自激、无毒性。这表明重组菌株已成功构建，可用来筛选NlPCE3的互作蛋白。