苏云金芽胞杆菌4.0718菌株Cry1和Cry2蛋白高产发酵条件的优化

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为了提高苏云金芽胞杆菌4.0718菌株的杀虫晶体蛋白产量,首先采用Plackett-Burman设计筛选出发酵培养基中影响苏云金芽胞杆菌4.0718 Cry1和总晶体蛋白产量的显著性因子为黄豆饼粉和MnSO4·H2O,Cry2的产量在该配方中无显著性影响因子。然后利用最速上升实验逼近Cry1最大产出区域,找到后续试验中心点。最后通过中心组合设计和响应面优化得到最佳培养基配方为(g/L):淀粉12,葡萄糖10,豆饼粉11.5,蛋白胨2.5,K2HPO4 2.5,FeSO4·7H2O0.02,MnSO4·H2O 0.02,MgSO4·7H2O 0.25。使Cry1和Cry2产量分别达到0.32 mg/mL和0.11 mg/mL,比原优选配方产量提高了两倍多。该优化配方发酵液对棉铃虫的半致死浓度(LC50)为1.09μL/mL,杀虫活性比原优化配方(LC50为3.10μL/mL)显著提高。通过单因子优化实验,得到了优化培养基的最佳起始pH为8.0,消泡剂(豆油)的最佳添加量应小于1%。为提高培养密度,采用直接提高培养基初始浓度法,发现高底物浓度对芽孢和晶体蛋白的形成产生了抑制作用,而在调整C/N基础上增加部分碳氮源含量能达到提高晶体蛋白的产量的目的。优化补料高密度工艺,筛选到了最佳补料培养基组成为葡萄糖和牛肉膏粉,最佳补料工艺为:在10、12、14h,分三次,以2:1的碳氮比补加12g/L的营养物质。为开展发酵罐分批补料高密度培养奠定了基础。通过单因子实验优化将培养基组成中碳氮源调整为葡萄糖18g/L和蛋白胨14.5g/L,优化出发酵最佳培养基配方。
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