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背景C1型尼曼-匹克病(NPC1)是由于Npc1基因突变引起的一种神经退行性疾病,目前尚无有效的治愈方法。研究发现,NPC1患者脑中存在严重的髓鞘形成障碍,如果不能及时和有效的治疗,将会影响神经的正常传导,导致神经轴突的变性以及神经元的死亡,引发严重的神经功能损伤。microRNA(miRNA)及其靶基因构建了细胞内全方位多层次的基因表达调控网络,在髓鞘形成及损伤中扮演关键的角色,参与调节神经系统的发育过程及神经退行性疾病的发生。因此,我们从髓鞘形成障碍入手,初步研究与髓鞘形成密切相关的miR-205-5p(miR-205)及其靶基因,并阐释其分子作用机制,研究Npc1-/-小鼠髓鞘形成过程,为治疗脱髓鞘性疾病提供新的基因及药物靶点,最终为临床的早期诊断及预防提供重要的参考依据。目的1.研究Npc1-/-小鼠不同发育时期脑组织不同部位的髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达和分布情况,揭示Npc1-/-小鼠脑组织髓鞘形成的表达模式;2.通过高通量Small RNA测序技术,筛选Npc1-/-小鼠脑中有显著差异的mi RNAs;3.对Npc1-/-小鼠脑中差异表达的miRNAs,进行靶基因预测及IPA功能与疾病分析,初步探讨miRNA参与NPC1髓鞘形成调控的分子机制。方法1.在小鼠出生后第7天(postnatal day 7,P7)进行基因型鉴定,Npc1-/-和Npc1+/+小鼠将被用于下列实验;2.分别取P9,P35,P60天小鼠,进行心脏灌注。分离完整脑组织进行4%PFA固定,18%蔗糖溶液脱水。OCT包埋剂包埋冷冻切片后,经免疫荧光组织化学方法分析小鼠脑组织在不同时期不同部位MBP蛋白表达情况;3.Western blotting技术检测P9,P35,P60天小鼠脑组织不同部位MBP蛋白表达情况,并用Fiji/ImageJ进行灰度扫描,定量分析。qPCR检测P35 Npc1-/-和Npc1+/+小鼠大脑皮层和海马组织中髓鞘形成相关蛋白表达情况;4.取P35天Npc1-/-和Npc1+/+小鼠海马组织进行Small RNA测序分析,筛选差异表达的miRNAs;5.对Npc1-/-小鼠中差异表达的mi RNAs进行靶基因预测及IPA功能与疾病分析;6.选择差异表达最显著的miR-205,通过qPCR检测Npc1-/-小鼠海马中miR-205及其靶基因的表达情况。结果1.随着小鼠的生长发育,脑中MBP蛋白的表达呈逐渐增加趋势。而Npc1-/-小鼠脑组织各部位MBP蛋白的表达均显著下降,且不同部位MBP呈现不同的表达模式;2.qPCR检测P35天Npc1-/-和Npc1+/+小鼠大脑皮层和海马组织中PLP,MAG,MOG和CNPase的表达情况,发现表达量均呈显著性降低;3.通过Small RNA测序分析,发现Npc1-/-小鼠海马中差异表达的miRNAs共有59个(P<0.05),其中表达上调27个,表达下调32个;4.对差异表达的miRNAs进行靶基因预测以及IPA疾病与功能分析,发现髓鞘形成障碍和脱髓鞘被显著富集,表明miRNA参与了NPC1髓鞘形成的调控;5.qPCR分析表明Npc1-/-小鼠海马中miR-205表达显著升高,其靶基因的表达呈现不同程度的降低,且Npc1-/-小鼠海马中MBP,PLP,MAG,MOG和CNPase蛋白表达显著降低,初步表明在Npc1-/-小鼠海马中miR-205通过其靶基因参与髓鞘形成的调控。结论1.Npc1-/-小鼠脑中髓鞘形成主要标志物MBP蛋白的表达模式具有时空差异性,且MBP,PLP等蛋白的表达显著下调,揭示Npc1基因的突变导致髓鞘形成障碍;2.Npc1-/-小鼠脑中差异表达的mi RNA参与了NPC1疾病的发生发展;3.Npc1-/-小鼠海马中miRNA-205的表达上调导致其靶基因表达下调,且髓鞘标志物MBP,PLP等蛋白表达显著下调,初步揭示miRNA-205在Npc1-/-小鼠海马中通过靶基因Csf1、Abcd1、Fam126a和Lpar1调控髓鞘形成。