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番茄（Solanum lycopersicum）是世界上栽培面积最大的蔬菜作物,而中国的番茄产量约占全球番茄产量的25%。然而,番茄是一种喜温性蔬菜,生长发育最适温度为1333°C,在我国北方无加温系统的日光温室内,冬季及早春的低温逆境严重降低了番茄的产量与质量。如何提高番茄的低温抗性,已成为冬春季节设施番茄栽培的主要问题。低温逆境不仅危害植物的生长发育,长期低温或极端低温甚至导致植物死亡。棉子糖家族寡糖（RFOs）作为植物体内第二大类糖,在植物生长发育及抵抗非生物胁迫中发挥重要作用。肌醇半乳糖苷（galactinol）的主要作用是作为RFOs生物合成的半乳糖基供体,其作用机制还不清楚。本课题以极耐寒植物新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）肌醇半乳糖苷合成酶基因（AnGolS1）超表达以及其背景中蔬6号番茄为试验材料,通过种子萌发期及幼苗期低温处理,初步明确AnGolS1超表达对番茄低温抗性的影响;通过RNA-Seq与代谢组分析,明确AnGolS1超表达对番茄内源基因表达及次生代谢产物生物合成的影响,综合探讨AnGolS1超表达提高番茄低温抗性的分子机制。试验主要结果如下:获得了纯合AnGolS1超表达转基因植株。尽管番茄拥有4个SlGolS基因,但这4个基因均为低表达基因;同时,仅SlGolS2响应低温显著上调表达,但其蛋白体外催化活性显著低于AnGolS1。以AnGolS1超表达T1代植株为材料,利用RT-PCR及western blot技术成功鉴定出阳性转基因植株,并发现转基因株系#19,#33和#41的分离比为3:1。此外,采用微滴式数字PCR（ddPCR）技术成功区分纯合体、杂合体及野生型植株。这些技术的运用,不仅成功鉴定出阳性转基因株系,同时大量节省选育纯合转基因植株的周期,为后续试验顺利展开提高重要试验材料。AnGolS1超表达转基因植株的低温抗性显著升高。在15°C和10°C恒定低温下,AnGolS1超表达番茄种子的萌发能力显著高于非转基因（WT）番茄种子;同时,AnGolS1超表达能提高番茄种子中肌醇半乳糖苷、蔗糖和葡萄糖的含量,并增加萌发7-d与10-d幼苗中肌醇半乳糖苷、果糖与葡萄糖的含量。此外,AnGolS1超表达不仅提高了番茄植株对4°C低温的抗性,还显著增强了植株的抗氧化活性;同时,AnGolS1超表达引起番茄植株成熟叶片果糖与蔗糖显著积累,而幼嫩叶片中仅肌醇半乳糖苷显著积累。因此,这些结果表明AnGolS1超表达通过调节可溶性糖的平衡以及增强抗氧化活性来提高番茄的抗冷性。肌醇半乳糖苷可能通过诱导乙烯信号提高番茄低温抗性。低温胁迫下,AnGolS1超表达诱导番茄多个代谢通路相关基因发生差异表达,尤其是乙烯（ET）信号转导相关基因,如1个ACC合成酶（ACS1）和5个ACC氧化酶（ACO）表达量显著上调;此外,乙烯响应转录因子（ERF）中SlERF.C6,SlERF.B4,SlERF.B5,SlERF.B13,SlDREB3,SlDREB,Solyc09g007260和SlERF053在低温处理的超表达番茄叶片中显著上调表达。同时,外源肌醇半乳糖苷显著提高ET的生物合成;外源ACC不仅显著提高番茄的抗冷性,还诱导SlDREB3,SlERF.B4,SlERF053,SlDREB和Solyc09g007260的转录;此外,外源肌醇半乳糖苷不仅提高低温下番茄种子的萌发能力,还能降低1-MCP的抑制效果,并且也能诱导SlDREB3,SlERF.B4,SlERF053,SlDREB和Solyc09g007260的转录。这些结果表明肌醇半乳糖苷能够诱导ERF转录,ERF正向反馈促进ET生物合成。AnGolS1超表达显著提高了低温下抗性相关代谢物积累。AnGolS1超表达引起番茄幼嫩叶片中87种代谢产物含量发生变化,其中多种氨基酸类（DL-多巴、L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸及L-（-）-酪氨酸等13种）、核苷酸类（2-羟基-6-氨基嘌呤、腺嘌呤及N6-琥珀酰腺苷等11种）、有机酸类（D-泛酸、甲基丁二酸及甲基戊二酸等8种）和脂质类（单酰甘油酯（酰基18:4）异构3、13-过氧十八碳二烯酸及12,13-环氧十八碳二烯酸等11种）显著积累。低温下,非转基因番茄叶片中代谢产物含量升高的仅有5种（DL-泛酰醇、阿糖肌苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、3-羟基吡啶及磷酸二乙酯）,而含量下降的却有12种,包括谷胱甘肽还原型、槲皮素、杨梅酮3-O-半乳糖苷及3-O-对香豆酰莽草酸。然而,低温下的超表达番茄叶片中却有123种次生代谢产物含量发生了变化,显著积累的代谢物主要是氨基酸类（DL-多巴、DL-高半胱氨酸及3-羟基犬尿素等12种）、核苷酸类（2-羟基-6-氨基嘌呤、腺苷-3’-5’-环单磷酸及N6-琥珀酰腺苷等13种）、有机酸类（D-泛酸、甲基丁二酸及壬二酸等6种）及脂质类（溶血磷脂酰胆碱19:0、4-氧代-十八碳四烯酸及12,13-环氧十八碳二烯酸等7种）。这说明肌醇半乳糖苷可能直接或间接诱导这些次生代谢产物的生物合成。初步明确了AnGolS1超表达诱导丝氨酸蛋白酶抑制因子SlSPI5提高番茄低温抗性机制。AnGolS1超表达引起番茄叶片中多种代谢物中的关联基因发生差异表达;低温下,尽管非转基因番茄幼嫩叶片中与代谢物关联的662个基因发生差异表达,但仅有5种代谢物含量升高。而AnGolS1超表达能诱导番茄叶片中与氨基酸、核苷酸、有机酸和脂质类代谢物生物合成的多个基因发生差异表达,但是某些差异代谢物的合成酶或分解酶基因表达却没有显著变化。例如,尽管7-O-奎宁酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、N6-琥珀酰腺苷和D-泛酸在转基因番茄叶片中显著积累,但它们的合成酶基因表达量在低温处理前后无显著变化,而影响这些酶活性的蛋白酶相关基因却发生了显著差异表达。试验初步表明AnGolS1能够诱导丝氨酸蛋白酶抑制因子SlSPI5的表达,SlSPI5又抑制枯草杆菌类蛋白酶SlSBT17的表达,促进丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Y1677的表达,Y1677蛋白激活7-O-奎宁酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸、N6-琥珀酰腺苷和D-泛酸合成酶的催化活性,从而促进这些代谢物的生物合成来提高番茄植株低温抗性。