碳酸氢根转运体NCBT剪切异构体的克隆、鉴定与表达分析

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酸碱平衡或pH影响许多重要的生理学过程,比如影响中枢系统的兴奋性以及哺乳动物的生殖过程等等。因此保持机体及细胞的酸碱稳态具有重要的生理学意义。细胞具有一系列复杂的分子机制来调控细胞内外环境的酸碱平衡。   SLC4家族(solute carrier 4 family)的钠离子偶联碳酸氢根转运蛋白NCBT(Na-coupled HCO3-transporter)在细胞pH调控以及HCO3–的跨上皮细胞转运中具有重要作用。这些NCBT包括五个不同基因的产物,根据离子转运模式的不同,可以将这些NCBT分为两类:(1)生电性的NBCe1(SLC4A4)、NBCe2(SLC4A5);(2)电中性的NBCn1(SLC4A7)、NBCn2(SLC4A10)、NDCBE(SLC4A8)。   由于转录启动子的不同或mNRA选择性剪切单元的存在,每种NCBT基因均可产生多种不同的剪切体。譬如编码生电性NBCe1的SLC4A4基因含有两个不同的转录启动子,此外,羧基端含有一个选择性剪切单元。理论上SLC4A4可以产生四种不同的NBCe1剪切体。前人已经发现三种NBCe1剪切体:NBCe1-A,NBCe1-B和NBCe1-C。NBCe1-A具有较短的独特的氨基末端(Nt),而NBCe1-B和C具有共同的较长的Nt。第二个例子是编码电中性NBCn2的SLC4A10基因,该基因目前已经发现有两个不同的选择性剪切单元。理论上SLC4A10基因也可以产生四种剪切体:NBCn2-A/B/C/D,前人的研究已经克隆了NBCn2-A/B/C的cDNA,但是NBCn2-D的cDNA还未见成功克隆。   本研究中,我们以小鼠为实验对象,对Slc4a4和Slc4a10选择性剪切异构体的表达进行了研究。我们通过RT-PCR技术,在mRNA水平上系统研究了NBCe1不同剪切体在小鼠的生殖道组织中的表达及分布。在小鼠生殖道组织中,我们成功地克隆并鉴定出了五种NBCe1的剪切异构体:NBCe1-A/B/C/D/E,其中NBCe1-D和NBCe1-E是我们首次克隆的新型剪切异构体。与NBCe1-A/B/C比较,NBCe1-D/E缺失了一段27碱基的序列,即cassette I。Cassette I是我们新发现的Slc4a4基因的一个选择性剪切单元,它的缺失由于Slc4a4的第六外显子的选择性剪切方式所致。   NBCn2主要表达在中枢系统中。在本研究中,我们通过cDNA克隆,从小鼠延脑(MD)和大脑皮下层(SCX)组织中均成功的克隆了NBCn2-D。通过菌落PCR技术,我们研究了NBCn2-A/B/C/D在小鼠脑组织中的相对含量。我们的结果表明,NBCn2-D在MD和SCX中的相对含量均非常低,提示NBCn2不同的剪切体在中枢系统中的表达具有很高的组织特异性。   我们的研究结果对于我们认识NBCe1及NBCn2的生理学作用具有重要意义。
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