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禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)是全球家禽以及野生禽类常见的传染病病原,又分为3个亚群5个种(A-E),12个血清型,其中血清4型在临床上主要表现为心包积液,2013年以来,我国多地血清4型禽腺病毒疫情给家禽业造成了严重的经济损失,然而目前国内尚无预防血清4型禽腺病毒的疫苗或药物可用,给该疫病的防控也带来了相当大的难度,市场急需一种能够预防当前国内鸡群禽腺病毒流行毒的优势疫苗。目前细胞悬浮培养技术在国内外已成功应用于口蹄疫、蓝耳病、禽流感疫苗的生产中,与传统的转瓶贴壁培养相比,由于在连续封闭的系统中进行,使得操作步骤简化,污染的机会显著降低,各种生产参数的自动控制与监测更为方便,培养条件稳定,改变了以往转瓶单层培养冗长繁琐的程序,对于提高细胞密度、增加产毒量、降低成本、减少污染、进一步完善禽腺病毒疫苗的生产工艺具有深远意义。1激流式生物反应器大规模培养血清4型禽腺病毒(JH株)的研究本研究主要以血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotybe 4,FAdV4)为研究对象,采用激流式生物反应器和一次性细胞培养袋,用纸片载体培养LMH细胞,成功完成了生物反应器培养FAdV4的生产工艺的摸索。我们对培养基血清含量,温度,PH,反应器转速,细胞接种量,培养时间,最佳接毒量分别进行了探索,最终摸索出最佳工艺参数。AP20生物反应器细胞悬浮培养最佳控制参数为:培养基血清加量为10%,温度(T)为37℃,DO不低于50%,pH为7.0-7.2,转速为40rpm。200g载体初始细胞最佳接种总数为(1±0.2)×109个细胞,细胞培养6日。生物反应器病毒最佳接毒比为MOI为0.1且加入2%的胎牛血清作为维持液,最佳收获时间为接毒后94-98小时,效价可达 109.0TCID50/mL。2禽腺病毒(Ⅰ群,4型)灭活疫苗(JH株)实验室产品试制及检验在以上研究中,摸索出使用AP20反应器制备高效价血清4型禽腺病毒(JH株)的流程以及最佳条件,以此为基础,我们制备了五批高效价血清4型禽腺病毒(JH株)抗原,并在实验室条件下成功试验制备了 5批FAdV4油乳剂灭活疫苗(JH株)。批号为 SY-201601、SY-201602、SY-201603、SY201604、SY-201605,经性状和无菌检验均合格。为了解疫苗的安全性,随机选取3批(SY-201602、SY-201603、SY201604),以14日龄SPF鸡进行安全性试验,对SPF鸡进行单剂量接种。试验结果显示,试验动物均未出现异常反应且增重正常。安全性试验表明,实验室试制的疫苗具有很好的安全性。为研究本疫苗对SPF鸡的免疫保护作用。将以上3批疫苗分别免疫14日龄SPF鸡,10只/组,同时设同日龄同品种鸡5只免疫等量PBS作对照组。免疫后21天测定中和抗体效价,同时进行攻毒保护试验。攻毒后连续观察14日,统计各组发病率。试验结果表明,21天后抗体效价均不低于1:32,且攻毒后,免疫组均保护,对照组均发病,实验室试制的3批疫苗对SPF鸡具有很好的免疫保护作用。3禽腺病毒(Ⅰ群,4型)灭活疫苗(JH株)对最小日龄靶动物、各种途径接种的一次单剂量安全性试验及效力检验选取14日龄的SPF鸡80只,分成八组,其中1-4组采用颈部皮下,5-8组采用腿部鸡肉注射0.3mL/只,分别接种三批疫苗和PBS对照,14天内观察鸡的精神状态,食欲等变化,14天后称重并剖检。结果显示,14天内,实验组和对照组鸡的精神状态和食欲并无明显异常,14天后称重显示,颈部皮下和肌肉注射和对照组相比均无明显差异,剖检显示,所有鸡免疫部位均无异常情况,表明疫苗吸收良好。一次单剂量接种结果表明,本疫苗以颈部皮下和腿部肌注方式一次单剂量接种14日龄SPF鸡安全。选取14日龄健康非免黄羽肉鸡,白羽肉鸡,蛋鸡各十五只,其中10只颈部皮下免疫201604批苗,另外五只注射PBS作为对照。所有鸡分别于免疫后21天采血,并进行攻毒保护试验,中和抗体效价攻毒后连续观察14天。各组鸡攻毒14天内,每日观察2次,收集各组死鸡并剖检,观察脏器病变,14天后,扑杀所有存活鸡并剖检,观察脏器病变。结果显示,3种商品鸡免疫本疫苗21天,抗体检测结果显示,免疫组中和抗体效价几何平均值分别为1:75.9,1:89.8和1:85.3,而对照组不高于1:2,存活率统计结果显示,对照组均于攻毒后14天内100%发病,免疫组均100%保护。剖检结果显示,对照组鸡攻毒后14天内发病鸡剖检可见相关禽腺病毒病变,免疫组剖检未见任何相关禽腺病毒病病变。攻毒保护结果表明,本疫苗对商品鸡具有很好的免疫保护作用。本研究通过纸片载体进行LMH细胞高密度培养,在自动控制的生物反应器中进行FAdV4最佳培养条件和收毒方式的探索,并试制了五批疫苗,显示出良好的安全性和保护性,从而为工厂化大规模培养FAdV4及制备高效灭活疫苗提供了理论依据和实践经验,具有很强的实用性。