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地球上广泛存在氧化无机硫化合物的细菌和古菌,其代谢产物均为硫酸,但两者的硫氧化途径和机理却大相径庭。大部分细菌通过硫氧化(sox)系统氧化无机硫化合物获得生长所需的能量。迄今为止,古菌中唯嗜热古菌能够氧化无机硫化合物,这一过程由硫氧化还原酶(SOR)酶系催化进行。在嗜酸热古菌Acidianus sp.中,硫磺首先被SOR氧化和歧化形成亚硫酸、硫代硫酸和硫化氢,产物再为下游酶系进一步氧化形成硫酸。第一步反应并没有能量贮存,所产生的能量以热量的形式耗散,只有后续反应与底物水平磷酸化或电子传递链偶联。SOR为嗜热古菌中硫代谢的关键酶之一,研究其催化机理及环境分布对于理解嗜热古菌硫氧化机制及环境功能(生物冶金)具有重要意义。
首先,利用SOR热稳定和分子量大的特性,通过热处理和分子筛的方法建立了一套快速纯化SOR的方案。序列比对结果和化学修饰实验初步证明SOR分子中的C31、C101、C104、H86、H90和E129氨基酸残基与该酶的催化活性密切相关,可能是该酶的催化活性中心残基,其中H86、H90和E129可能结合一个Fe2+组成非卟啉铁中心。进一步的定点突变结果表明,这六个氨基酸残基的突变体几乎都丧失了SOR活性;圆二色光谱和内源荧光光谱证明这些位点的突变并没有对SOR的构象造成影响,说明它们与维持SOR的结构无关;此外,原子发射光谱结果显示H86,H90和E129与铁离子的结合相关,可能为Fe2+的结合位点。根据上述结果推测SOR的反应机理为:C31为底物(S8)结合位点,形成Cys-S-Sn-H的多硫化合物,C101-X-X-C104模体参与氧化还原反应;H86-X-X-X-H90和E129模体结合Fe2+形成一个非卟啉亚铁中心,活化分子氧,催化氧化还原反应。
其次,根据SOR基因的两个保守区(V26-G-P-K-V-C31和D86-H-E-E/D-M-H90)设计了一对简并引物,结合简并PCR和SiteFinding PCR方法建立了检测和克隆环境样品中SOR基因的方案。通过对不同环境样品的检测,对此方法可操作性和灵敏性进行验证,并从生物冶金反应器样品中克隆得到了两个全新的SOR基因——sorSA和sorSB。对sorSB进行异源表达显示其表达产物具有SOR活性,酶特性也与已知的SOR相似。荧光定量PCR结果揭示sorSA和sorSB可能来源于细菌,通过分离培养最终证实sorSB来源于Acidithiobacillus sp.SM1,这是迄今为止第一个来源于细菌SOR的报道。荧光定量PCR测定反应器中细菌与古菌的种群数量以及SOR基因的分布表明,在生物冶金环境中大量存在含有SOR基因的古菌和细菌,推测SOR基因在此环境的硫氧化过程中具有十分重要的功能。