肺癌是导致全球死亡病例最多的恶性肿瘤之一,5年生存率仅约15.6%。非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)占肺癌的80%-85%,主要包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞癌等。病理类型、肿瘤分期等临床特征是恶性肿瘤重要的预后因素。近期发现,液相活检比如循环外泌体(circulating exosome,crExo),也能为恶性肿瘤提供重要的预后信息。外泌体是起源于内体的、直径30nm-150nm的细胞外囊泡。外泌体中有多种类型的分子,包括蛋白质、miRNA、m RNA、DNA等。且外泌体参与细胞之间的物质交换和信息传递,从而发挥生物学功能。许多恶性肿瘤的crExo内含物不同于非肿瘤人群,并且可能和肿瘤的进展情况密切相关。有证据表明,crExo中的内含物比如RNA、蛋白质等,可作为某些恶性肿瘤的生物标志物。为了探讨外泌体在NSCLC患者中的预后作用及其机制,本文进行了如下研究:第一章血浆中外泌体浓度在非小细胞肺癌预后中的作用目的研究血浆中crExo浓度与NSCLC患者临床特征及预后的关系。方法将血浆crExo用商业化试剂分离后,用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、western blot及Nano Sight进行鉴定。使用乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E)法、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法和纳米颗粒追踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)定量20个NSCLC患者crExo浓度,并分析这三种方法结果之间的关联性。选择与NTA法关联性更强的定量方法测定NSCLC患者的crExo浓度。并分析crExo浓度与NSCLC患者的临床特征及总生存期(overall survival,OS)之间的关系。结果1、分离的crExo样品电镜下为圆形,直径在30nm-100nm之间。western blot结果表明,crExo样品表达外泌体标志物蛋白CD63和CD9,轻微表达albumin,而不表达内质网蛋白标志物calnexin。Nano Sight结果表明,样品粒径在50nm-150nm之间,粒径众数为73nm。这些结果说明,用本法分离crExo是可行的。2、三种外泌体定量方法(BCA法、ACh E法和NTA法)的结果之间彼此相关。ACh E法与NTA法的关联强度(r=0.79,P<0.001)要大于BCA法与NTA法的关联强度(r=0.64,P=0.003)。3、采用ACh E法测定208例NSCLC患者crExo浓度,发现晚期(IIIb-IV期)患者的crExo浓度高于早期(I-IIIa)患者(P<0.001),合并COPD的患者crExo浓度高于未患COPD的患者(P=0.023)。crExo浓度在不同性别、不同吸烟状况或不同病理类型的NSCLC患者之间没有统计学差异。crExo浓度与NSCLC患者的年龄也没有统计学关联。4、Cox比例风险模型结果提示,校正吸烟状态、肿瘤分期、手术及化疗因素后,高浓度crExo是NSCLC患者独立不良预后因子(P=0.033;HR=1.72,95%CI:1.05-2.83)。时间依赖性受试者工作特征曲线下面积(area under the ROC curve,AUC)结果表明,加入crExo浓度这一因素使得Cox模型预测结局的效能总体趋于好转。但是,在随访6个月、12个月、18个月及24个月时,两个模型预测结局能力的差异都没有统计学意义结论crExo浓度与NSCLC患者的肿瘤分期及是否合并COPD有关,并可作为NSCLC患者独立预后因子。第二章血浆中外泌体miRNA在非小细胞肺癌预后中的作用目的探讨肺腺癌与健康对照crExo中miRNA表达谱的差异,并研究crExo miRNA在NSCLC患者预后中的意义。方法用miRNA芯片检测10例肺腺癌和10例匹配(年龄、性别、吸烟状况)健康对照的crExo miRNA表达谱。用18个crExo样品评估四个候选内参基因(SNORD49A、let-7a-5p、miR-30a-5p和miR-30e-5p)的稳定性。根据芯片结果并结合既往文献,选择若干crExo miRNA以研究它们在NSCLC患者预后中的作用。结果1、芯片检测的84个miRNA中,有25个miRNA和5个miRNA在肺腺癌患者crExo中分别为低表达和高表达。2、内参评估结果表明,在四个候选crExo内参基因中,let-7a-5p最稳定。3、根据miRNA芯片差异表达结果及相关文献,选择9个crExo miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-19a-3p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-141-3p、miR-21-5p、miR-375和miR-1290),以评估它们在NSCLC患者预后中的意义。其中,crExo miR-21-5p、miR-375和miR-1290是通过文献复习而选择的。结果表明,miR-21-5p、miR-375和miR-1290均在NSCLC患者crExo中高表达。4、以let-7a-5p为内参,使用q PCR检测196例NSCLC患者crExo中以上9个miRNA的表达。Cox比例风险模型表明,crExo中miR-23b-3p(P=0.001;HR=2.42,95%CI:1.45-4.04)、miR-10b-5p(P=0.013;HR=2.22,95%CI:1.18-4.16)和miR-21-5p(P=0.003;HR=2.12,95%CI:1.28-3.49)为NSCLC患者独立预后因子。时间依赖性AUC结果表明,加入这三个crExo miRNA后,Cox模型预测结局的效能整体好转。在随访12个月时,AUC从0.88增大到0.91(P=0.015)。结论肺腺癌患者与健康对照相比,crExo的miRNA表达谱有统计学差异。let-7a-5p可作为crExo miRNA定量研究中的内参基因。crExo中的miR-23b-3p、miR-10b-5p及miR-21-5p表达水平可作为NSCLC患者独立预后生物标志;与单纯用临床指标的预后模型相比,加入这三个crExo miRNA可以增加模型预后预测的效能。第三章肺癌细胞外泌体在上皮-间质转变中的作用研究目的上皮-间质转变(epithelial-mesenchymal transition,EMT)与肿瘤侵袭和转移过程密切相关。本部分主要目的是研究肺癌细胞外泌体在EMT中的作用。方法TGF-β1刺激A549肺腺癌细胞后,通过形态学观察及EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的检测,评估A549细胞是否发生EMT。采用超速离心法分离A549细胞条件培养基中的外泌体(conditioned medium-derived exosome,CM-Exo),并用TEM、Nano Sight和western blot对CM-Exo进行鉴定。确定CM-Exo miRNA最稳定表达的内参基因后,检测A549细胞及其CM-Exo在EMT过程中8个miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-19a-3p、miR-21-5p、miR-1290和miR-375)的表达。用PKH67荧光染料标记CM-Exo后,观察肺癌细胞能否摄取CM-Exo。并研究CM-Exo能否促进A549肺癌细胞发生EMT。结果1、TGF-β1诱导后,A549细胞发生了符合EMT特征的形态变化及分子特征变化。本研究中,与Vimentin及N-cadherin相比,上皮性标志物E-cadherin是更加敏感的EMT标志物。2、TEM、Nano Sight和western blot结果均表明,超速离心法分离的CM-Exo样品符合外泌体的特征。3、用q PCR检测了12个CM-Exo样本中四个候选内参let-7a-5p、5s r RNA、miR-16-5p和U6的表达。用在线工具Ref Finder分析q PCR数据,结果表明U6是CM-Exo最稳定的内参基因。4、发生EMT的A549细胞中,8个miRNA表达均下调(FC[fold change,倍数变化]<1.00,P<0.05);其分泌的CM-Exo中则显著富集了miR-21-5p(FC=6.03,P<0.001)和miR-23b-3p(FC=2.96,P<0.001),但miR-10b-5p的表达无显著变化(FC=0.91,P=0.144)。此外,在发生EMT的细胞分泌的CM-Exo中,miR-1290(FC=0.27,P<0.001)、miR-194-5p(FC=0.81,P=0.017)和miR-19a-3p(FC=0.57,P=0.006)表达水平下降;let-7g-5p(FC=1.55,P=0.013)、miR-375(FC=1.21,P=0.046)表达水平有所上升。5、肺癌细胞的CM-Exo能促进A549细胞发生EMT分子表型变化,且发生EMT的细胞分泌的CM-Exo促EMT效应更明显。结论发生EMT的肺癌细胞分泌的CM-Exo中显著富集了miR-21-5p和miR-23b-3p,且能促进A549细胞EMT分子表型改变。