论文部分内容阅读
背景和目的:随着化疗药物对肺癌的疗效达到平台,肺癌分子靶向治疗成为研究的热点,尤其是对EGFR基因的研究,研究发现80%以上的肺癌患者EGFR高表达,针对EGFR分子治疗的药物有多种,其中EGFR胞内酪氨酸激酶的小分子抑制剂,即EGFR-TKI在临床研究发现,EGFR-TKI对于大部分EGFR突变的患者,初始有非常好的疗效,尤其对突变类型为19外显子的缺失突变和21外显子的L858R点突变患者,随着药物应用时间的延长,都不可避免的产生耐药。关于获得性耐药的机制主要包括EGFR的T790M二次突变和MET基因扩增,约占70%,尚有30%-40%的耐药机制不清楚,主要有IGF-1R高表达、HGF高表达、PTEN表达缺失或功能异常等。为进一步研究EGFR-TKI获得性耐药机制,我们利用Erlotinib诱导HCC827-P产生获得性耐药细胞株HCC827-TR,通过MTS验证其耐药性后,利用基因芯片普筛与耐药有关的差异基因,用不同方法对已知EGFR-TKIs获得性耐药机理的筛查。方法:1.人体外培养HCC827-P细胞,并用Erlotinib诱变和药物筛选耐药细胞株HCC827-TR,应用 MTS 细胞毒性试验检测 HCC827-P 和 HCC827-TR 对 Erlotinib及Gefitinib的药物敏感性。2.提取总RNA,交给Affymetrix芯片公司做基因芯片,通过MAS3.0软件分析出与肺癌相关的信号通路和差异基因。3.提取基因组DNA,Realtime-PCR检测HCC827-TR、HCC827-P细胞内MET基因拷贝数。4.提取总RNA,进行反转录成cDNA,Realtime-PCR检测HCC827-TR、HCC827-P细胞内MET、PTEN表达水平,对EGFR进行PCR扩增并测序。5.Western-blot检测HCC8827-P和HCC827-TR内 p-ERK、p-AKT表达水平。结果:1.Erlotinib耐药细胞株HCC817-TR诱导成功,MTS试验结果表明,当Erlotinib和Gefitinib的药物浓度为100nM时,HCC827-P和HCC827-TR的细胞生长抑制率分别为 57.7%、52.9%和 3.0%、0.1%,HCC827-TR 和 HCC827-P 比较表现为明显的耐药。2.基因芯片的结果,HCC827-TR和HCC827-P细胞间存在1481个差异基因,727个上调基因,754个下调基因,其中73个差异基因参与11条肺癌相关的信号通路,与肺癌信号通路相关差异基因中MET、TGFB2、VEGF、MAPK、AKT3表达上调,而EGFR、IGF1、PI3R3表达下调。3.基因测序结果表明,HCC827-TR和HCC827-P细胞均存在EGFR19外显子确实突变,但无T790M突变。4.实时定量PCR可知,HCC827-TR和HCC827-P二者的MET基因拷贝数和基因表达量一致,二者的PTEN表达一致。5.EGFR抑制剂Erlotinib,可显著抑制HCC827-P细胞内下游信号蛋白p-ERK、p-AKT,而对HCC827-TR的抑制作用较弱。结论:1.成功制备了 HCC827-TR耐药细胞系。2.基因芯片的分析结果为进一步研究耐药机制提供了很好的方向指导。3.HCC827-TR对Erlotinib耐药与EGFRT790M突变无关;与PTEN表达缺失无关;与MET基因扩增的关系尚不明确,待进一步探讨。4.HCC827-P细胞内Erlotinib可显著抑制EGFR下游信号通路,而对HCC827-TR细胞抑制作用不显著。