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2010年底,中国多省市暴发猪流行性腹泻,引发数以百万计的仔猪死亡,给中国乃至世界生猪产业带来了灾难性损失。同时,临床流行病学研究发现,即使在疫苗免疫猪场,仍呈现了高水平的感染率和死亡率。为了解现流行PEDV毒株的遗传变异情况,本研究参考GenBank中PEDV经典CV777毒株基因组序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法对临床采集的疑似PEDV样品进行S基因和ORF3基因扩增、克隆和测序,并拼接获得完整S基因和ORF3基因序列各8条,进一步对本研究毒株进行遗传进化及同源性分析。结果显示,与经典CV777毒株的S基因核苷酸相似性介于93.6%94.1%,ORF3基因核苷酸相似性介于95.7%96.6%。推导的S蛋白氨基酸序列进行比对显示,S1区存在91个氨基酸突变位点,占总数的61.9%（91/147）,,暗示PEDV的S1区域比S2区域易发生变异S1和S2区均存在氨基酸插入和缺失现象;ORF3蛋白存在17处氨基酸突变,未见缺失和插入现象。表明目前中国PEDV流行株已经发生了变异,在一定程度揭示了免疫猪群仍然发病的原因。有研究表明,S蛋白的636769 aa区域S1D蛋白能够刺激机体产生中和抗体,并且制备的血清具有中和PEDV S天然蛋白的效力。为此,本试验通过pET-28a原核表达系统,成功表达出分子量约为21 kDa的目的蛋白。经重组蛋白诱导条件的优化、亲和层析纯化后成功获得了融合蛋白。Western blot结果显示重组蛋白在NC膜上有目的条带出现,且空质粒表达菌对照成立,表明本蛋白具有良好的反应原性。将纯化的重组S1D蛋白与弗氏佐剂乳化后,免疫新西兰大白兔三次后,获得了兔抗重组PEDV S1D蛋白的多克隆血清。Western blot结果显示,具有良好免疫原性,同时以纯化后的复性蛋白作为抗原包被后,运用方阵法建立的间接ELISA方法测定该多克隆血清,效价高于为1:12800,表明制备的兔多克隆血清具有较好的特异性,且S1D蛋白具有良好的免疫原性。以重组S1D蛋白作为包被抗原,待检血清为一抗,兔抗猪IgG-HRP为二抗,通过反应条件优化,建立了检测猪血清中PEDV抗体水平的间接ELISA方法。其中重组S1D蛋白作为包被抗原量是1μg/孔,37℃放置2 h后4℃包被过夜,最佳封闭条件为1%BSA 37℃封闭2h,待检血清（200倍稀释）37℃作用1 h,二抗6000倍稀释后37℃作用1 h,TMB显色液37℃作用15min。应用建立的间接ELISA方法测定30份PEDV阴性血清OD450值,阳性血清临界值和阴性血清临界值分别为阴性血清的平均值加上3倍的标准差（X+3SD=0.310）和阴性血清的平均值加上2倍的标准差（X+2SD=0.279）,其间为可疑需重新测定。同时与猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒的阳性血清进行的特异性试验,不产生交叉反应,证实该方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数小于5%和10%,表明建立的间接ELISA方法具有很好的重复性和稳定性。应用建立的间接ELISA方法对来自河南各地市猪场送检的69份临床猪血清进行检测,检出PED抗体阳性样品55份,阳性率为79.71%（55/69）。综述所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于猪血清中PED抗体的检测,为临床上猪群中PED血清流行病学调查和疫苗效力评估提供了确实可行的技术手段。