论文部分内容阅读
Micro RNA(mi RNA)是近年来鉴定的具有重要转录后调控功能的非编码RNA,由于每个mi RNA的靶基因众多,而位于mi RNA基因上的单核甘酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNP)能够改变其加工过程或其对靶基因的选择进而影响该mi RNA功能的发挥,因此鉴定与揭示mi RNA SNPs的功能与作用显得尤为重要。本研究的主要目的是探究位于mi R-1666前体区的SNP是否影响mi RNA成熟体的生成,揭示mi R-1666的生物学功能以及该SNP对mi R-1666功能的影响。该研究用生物信息学方法筛选出鸡mi R-1666前体区存在的SNP,以河南省家禽种质资源创新工程研究中心构建的固始鸡-安卡鸡F2代资源群为研究材料,DNA测序和PCR-RFLP的方法鉴定出位于资源群mi R-1666基因的SNP并进行基因分型,与资源群的肉质性状、生长性状、屠体性状等经济性状进行关联分析初步揭示该SNP的功能;通过构建mi R-1666不同等位基因的p EGFP-N1表达载体并转染DF1细胞,用荧光定量的方法检测该SNP对成熟mi RNA生成的影响;用双荧光素酶报告系统结合荧光定量的方法鉴定和验证mi R-1666的靶基因,并探究该SNP对mi R-1666靶基因调控的影响。本研究主要得到以下结果:1.生物信息学结合测序鉴定的方法在固始鸡和安卡鸡F2代资源群中检测到唯一一个位于mi R-1666前体区上的突变位点即rs14120863(C/G)。与F2代资源群经济性状关联分析表明,该SNP与鸡的半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重及部分体尺性状包括胫围、胸深、胸骨长和体斜长存在显著关联,且CC型个体显著优于GG型。2.M-fold软件预测显示该SNP能够引起碱基的错配进而产生一个新的凸起且该SNP改变了mi R-1666二级结构的最低自由能,自由能由G等位基因的-37.5kcal/mol改变为C等位基因的-35.2kcal/mol,二级结构的稳定性降低。荧光定量结果显示固始-安卡鸡F2代资源群中GG基因型个体胸肌组织样中成熟mi R-1666的表达量显著高于CC基因型;通过构建mi R-1666不同等位基因的p EGFP-N1表达载体并转染DF1细胞,荧光定量检测表明G等位基因成熟mi R-1666的表达显著高于C等位基因,与上述结果相符。结果表明mi R-1666前体区的rs14120863 SNP能够影响成熟mi R-1666的生成。3.生物信息学的方法结合荧光定量技术筛选出ARF6,CBFB和TAB2为mi R-1666的候选靶基因,进而通过构建上述三个基因的psi-Check2双荧光素酶报告载体,确定CBFB为mi R-1666的一个靶基因,而ARF6和TAB2并非其靶基因。最终通过荧光定量检测mi R-1666不同等位基因对靶基因CBFB的调控作用,结果显示该SNP能够影响mi R-1666对CBFB的调控能力。由以上试验结果,可得出如下结论:Mi R-1666前体区的SNP能够改变成熟mi R-1666的表达量,进而影响mi R-1666对靶基因CBFB的调控作用,由此可能导致该SNP与鸡的体尺性状显著相关,而在鸡的生长发育过程中扮演重要的角色。