【摘 要】
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目的本研究选用骨细胞MLO-Y4,通过慢病毒LV-CRISPR/Cas9构建敲除Jag1的MLO-Y4-△Jag1稳转株,探究骨细胞Wnt信号是否通过Wnt-Jag1通路促进骨髓基质细胞的成骨分化以及其他可能的通路;构建过表达Jag1的MLO-Y4-Jag1稳转株,探究骨细胞Jag1对骨髓基质细胞成骨分化的影响以及其潜在的骨组织工程应用潜能。为靶向骨细胞Jag1促进骨生成药物研发以及骨组织工程修复
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目的本研究选用骨细胞MLO-Y4,通过慢病毒LV-CRISPR/Cas9构建敲除Jag1的MLO-Y4-△Jag1稳转株,探究骨细胞Wnt信号是否通过Wnt-Jag1通路促进骨髓基质细胞的成骨分化以及其他可能的通路;构建过表达Jag1的MLO-Y4-Jag1稳转株,探究骨细胞Jag1对骨髓基质细胞成骨分化的影响以及其潜在的骨组织工程应用潜能。为靶向骨细胞Jag1促进骨生成药物研发以及骨组织工程修复骨缺损提供理论依据。方法1.使用Wnt信号激活剂激活MLO-Y4的Wnt信号,并且与ST2在含有Notch信号抑制剂DAPT的培养基中共培养,探究Notch信号是否介导骨细胞Wnt信号促骨髓基质细胞的成骨分化。2.慢病毒p LV[g RNA]-EGFP,p LV[Exp]-CBh>h Cas9（ns）转染MLO-Y4,构建Jag1敲除的稳转株MLO-Y4-△Jag1,并激活其Wnt信号,再与ST2进行共培养,探究骨细胞是否通过Wnt-Jag1促骨髓基质细胞的成骨分化。3.腺病毒BMP4（Ad-BMP4）感染ML0-Y4,然后与ST2在含有Notch信号抑制剂DAPT的培养基中共培养,探究Notch信号是否介导骨细胞BMP4促骨髓基质细胞的成骨分化。4.慢病毒LV-Jag1、LV-jag2分别转染MLO-Y4,构建稳定过表达Jag1/Jag2的稳转株MLO-Y4-Jag1、MLO-Y4-Jag2,再分别与ST2进行共培养,探究骨细胞单个Notch配体Jag1/2的对骨髓基质细胞成骨分化的影响。5.细胞材料一体化打印构建含有MLO-Y4-Jag1和ST2的功能模块,探究骨细胞Jag1在骨组织工程的应用潜能。6.通过ALP活性（ALP染色及生化定量）和成骨分化标志基因（Alp、Osx、Ocn、Runx2、Col I、Bsp）的表达检测成骨分化能力。结果1.激活Wnt信号的MLO-Y4显著促进共培养体系中ST2的成骨分化,当抑制Notch信号以后,ST2的成骨分化降低。2.通过LV-CRISPR/Cas9敲除MLO-Y4中的Jag1稳转株MLO-Y4-△Jag1构建成功;Wnt信号激活的MLO-Y4-△Jag1促ST2成骨分化能力减弱。3.Ad-BMP4成功感染MLO-Y4,显著促进共培养体系中ST2成骨分化,抑制Notch后,成骨分化降低。4.过表达Jag1、Jag2的稳转株MLO-Y4-Jag1、MLO-Y4-Jag2构建成功,与ST2共培养,MLO-Y4-Jag1促进ST2成骨分化,抑制Notch信号后,成骨分化降低,MLO-Y4-Jag2对ST2成骨分化并无促进作用。5.3D打印构建MLO-Y4-Jag1功能模块促进ST2的成骨分化以及矿化。显示其在组织工程修复骨缺损的应用潜能。结论1.激活骨细胞MLO-Y4的Wnt信号可能通过上调的Jag1以及BMP4促进骨髓基质细胞的成骨分化,该过程可能与经典的Notch信号的激活有关。2.骨细胞MLO-Y4过表达Jag1促进骨髓基质细胞成骨分化并且展现出其在骨组织工程的应用潜能,而骨细胞过表达Jag2并无促进骨髓基质细胞成骨分化功能。
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