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研究背景与目的核纤层蛋白病(laminopathy)是一组由LMNA基因突变及其编码的lamin A/C蛋白异常所引起的遗传病。我们确诊了一例核纤层蛋白病,一位26岁女性其特征为青春期开始时近似全身性脂肪萎缩;严重的胰岛素抵抗和糖尿病;高甘油三酯血症;脂肪肝;局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)和高血压。通过基因测序发现在LMNA基因2号外显子处第133位密码子由CGG→CTG,所编码的氨基酸由精氨酸突变为亮氨酸。其6岁的儿子携带了相同的突变,但目前无脂肪营养不良表型。基于以上病例本研究进一步探讨LMNA R133L对脂肪细胞(3T3-L1细胞)、肾小球系膜细胞(SV40 MES 13细胞)核形态结构的影响,以及在脂肪细胞分化、全基因组表达谱和胰岛素信号传导途径方面的影响,并寻找下游可能作用的靶蛋白。方法3T3-L1细胞(前脂肪细胞)、肾小球系膜细胞(SV40 MES 13细胞)通过感染人源LMNA野生型(LMNA WT)和LMNA R133L突变慢病毒,获得LMNA WT和LMNA R133L突变细胞模型。免疫荧光法观察细胞核形态及lamins蛋白的表达。用嘌呤霉素稳定筛选阴性对照、LMNA WT和LMNA R133L突变前脂肪细胞,成功构建稳筛细胞系后进行成脂诱导分化,观察LMNA R133L突变对脂肪细胞分化的影响,q RT-PCR检测分化相关基因m RNA表达。Western Blot检测胰岛素信号转导途径相关蛋白表达。小鼠基因芯片用于研究全基因表达谱。提取LMNA WT和LMNA R133L突变细胞核蛋白,通过蛋白质pull-down实验联合质谱分析寻找两组中与lamin A/C结合蛋白的差异性。结果1.在过表达LMNA R133L突变前脂肪细胞及肾小球系膜细胞中,均观察到细胞核形态大小不一,并出现核膜内陷或出泡。免疫荧光染色显示,A型核纤层蛋白(lamin A)不规则地分布在核被膜周围;与阴性对照或LMNA WT细胞相比,LMNA R133L突变细胞lamin B染色亦不均匀。2.稳定表达LMNA R133L突变的3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的分化受损。脂肪细胞分化相关基因(包括PPAR、SREBP-1c和Nipbl)的表达水平降低。与阴性对照和LMNA WT细胞相比,LMNA R133L突变细胞中Col11、Col41、Col61、Mmp2和Adamts-7等细胞外基质基因的表达受到抑制,Angpt1和Rora等血管生成基因的表达明显下调。3.稳定表达LMNA R133L突变的脂肪细胞中,胰岛素介导的PI3K/Akt活性和下游Glut-4细胞膜转运明显抑制;PPAR的表达亦显著被抑制。4.瞬转LMNA WT与LMNA R133L突变慢病毒的3T3-L1前脂肪细胞,诱导分化至第4天,提取细胞总RNA行全基因组表达谱分析(One-array),通过KEGG通路(KEGG pathway)富集分析发现,LMNA WT与LMNA R133L突变细胞差异表达基因的通路主要与代谢途径有关;Go富集分析揭示,在分子功能(Molecular function)和生物过程(Biological process)方面,最显着的差异表达基因与RNA结合及细胞对DNA损伤的反应以及DNA修复有关。5.瞬转LMNA WT与LMNA R133L突变慢病毒的3T3-L1前脂肪细胞,提取核蛋白,以lamin A/C抗体及Flag标签抗体行pull-down实验,筛选LMNA WT与LMNA R133L细胞核蛋白中与lamin A/C结合蛋白的差异,发现R133L突变引起lamin A/C与AHNAK结合减少;Western Blot和细胞免疫荧光染色发现LMNAR133L细胞AHNAK表达量明显降低。结论LMNA R133L突变与脂肪营养不良和多系统疾病相关,LMNA R133L突变很可能引起脂肪细胞的更新障碍,此过程可能与LMNA R133L突变引起DNA损伤增加及修复障碍有关,而后者可能与突变导致lamin A/C-AHNAK结合减少有关。