禽流感(AivanInfluenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的传染性疾病综合症。低致病力禽流感常引起呼吸道症状，产蛋量下降。1994年首次报道H9N2亚型AIV在中国流行，并且已成为中国现有AIV的主要亚型。近几年发现，H9N2亚型AIV不仅感染禽类，还感染猪和人。因此，开展对禽流感病毒H9N2亚型的研究，加强对H9N2亚型AIV的监控，不仅在病毒学、兽医学等学科上有重要的学术意义，而其公共卫生等方面也具有重大的社会意义。 本试验根据GenBank所发表的HA基因的cDNA序列，利用Primer5.0软件，参照昆虫细胞杆状病毒表达系统的质粒图谱，设计一对引物，以本实验室所保存的pMD18-T-HA2阳性质粒为模板扩增出HA2基因，命名为BHA2。将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A的BamHI和SalⅠ之间的多克隆位点上，命名为pBlueBacHis2A-BHA2。纯化该重组质粒并与杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，5d后获得重组病毒，名为P1。将经过3轮噬斑筛选纯化P1接种Sf9细胞大量繁殖后收获，PCR鉴定结果为完全纯化的病毒命名为P2。接种P2于Sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，经SDS-PAGE电泳鉴定，表达产物BHA2融合蛋白分子量约为27KU，与理论值相符。该表达产物的Western-blotting和Dot-ELISA结果表明其可与鸡抗H9N2亚型血清发生特异性抗原反应，而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。 同时参照毕赤酵母表达系统pPIC9K质粒图谱设计引物，扩增出HA2基因，命名为YHA2。将其克隆至毕赤酵母转移载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ之间的多克隆位点上构建重组质粒pPIC9K-YHA2。将其salⅠ线性酶切，电转化将其整合到毕赤酵母菌GS115染色体上，利用MD平板筛选His+阳性克隆；用含不同浓度G418-YPD平极筛选高拷贝转化子；利用PCR法筛选Mut+阳性克隆。将筛选到的高拷贝进行BMMY摇瓶培养，甲醇诱导表达重组蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western-blotting分析，重组目的蛋白得到表达，相对分子量为35KD，较理论值27KU大，由于HA2存在糖基化位点，分析为糖基化所致。 HA2基因在昆虫细胞杆状病毒表达系统和毕赤酵母表达系统成功获得了表达，并且分析具有作为检测抗原检测H9N2亚型AIV感染的条件，为H9N2亚型AIV诊断方法的建立奠定了基础。