炭角菌与鸡枞菌的纯培养及小分子活性成分研究

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炭角菌Xylaria隶属于子囊菌纲(Ascomycetes)球壳目(Sphaeriales)炭角菌科(Xylariaceae),常生长于大白蚁亚科白蚁巢中,但在有白蚁生活的蚁巢中,其生长被抑制,常发现于白蚁迁移后的废弃蚁巢。由于炭角菌在地面的子实体期很短,目前能规模化纯培养的种少有报道。炭角菌是非常珍贵的药用材料,其具有抗衰老、镇惊安神、延长寿命等功效。鸡枞菌隶属于担子菌纲(Basidiomycetes)、伞菌目(Agaricales)、离褶伞科(Lyop Hyllaceae)、蚁巢伞属(Termitomyces),与白蚁共生,当蚁巢遭到破坏时,鸡枞菌不会生长。因其共生机理研究薄弱,至今尚难以人工培养。鸡枞菌为名贵的野生食用菌,鸡枞多糖具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤等功效。本文从迁移回实验室、蚂蚁已死亡的蚁巢上分离到两种炭角菌和一种鸡枞菌,并建立了能规模化生产的炭角菌纯培养体系。因此本研究以蚁巢、两种炭角菌、鸡枞菌子实体以及纯培养菌丝体为材料,利用核磁共振技术(NMR)及气相质谱联用技术(GC-MS),分别对5种材料中的小分子活性物质进行了定性定量分析,并利用SIMCA-P 14.0软件分别对5种材料进行两两分析其间的差异性物质,这为炭角菌、鸡枞菌的规模化人工发酵或培养,为相关药物的开发奠定了重要理论基础。本文的主要研究内容及结果如下:1.分离到了两种炭角菌,并利用ITS分子标记,对其进行鉴定,初步确定为痂状炭角菌(Xylaria escharoidea)和阔角炭角菌(Xylaria angulosa);分离到了一种鸡枞菌,并结合子实体特征初步定名为皱皮粗柄鸡枞菌(Termitomyces robustus var.Yuan PY)。两种炭角菌已能较大规模地培养,这是本文的重要创新点及后续研究的基础。2.对其两种炭角菌的生活周期进行观察记录发现,痂状炭角菌和阔角炭角菌的形态及生长方式明显不同:痂状炭角菌的生长如同树状,即先从接种物上沿培养基表面萌发一些根状的菌丝,这些菌丝扭结成粗状的菌索,向上生长,生长端少有分枝,子实体成熟以后,呈棒状或枯树状,外表面变为黑色,但菌索内部及生长端仍为白色;阔角炭角菌的生长如同花丝状,先从接种物上向四周及向上密集生长许多细枝或细丝状的菌索,菌索生长端先膨大后分枝,成熟子实体的菌索基部表面也变黑色,内部及生长端仍为白色。3.利用NMR技术对5种材料进行了定性及定量分析,一共指认出58种小分子活性物质,其中氨基酸及其衍生物类26种、糖类11种、盐类5种、醇类5种、酸类3种、其它类8种。痂状炭角菌、阔角炭角菌、蚁巢、皱皮粗柄鸡枞菌子实体以及菌丝体,分别被鉴定出33种、19种、18种、31种、26种物质。4.利用GC-MS技术对5种材料进行了定性定量分析,一共指认出95种小分子活性物质,其中痂状炭角菌、阔角炭角菌、蚁巢、皱皮粗柄鸡枞菌子实体以及菌丝体,分别为40种、51种、27种、51种、42种,95种物质中氨基酸及其衍生物类18种、糖类25种、醇类12种、酸类26种、核苷类4种、其它类10种。5.两种技术比较结果表明,(1)痂状炭角菌,两种方法共检测到65种物质,其中~1H-NMR 33种,GC-MS 40种,共同8种;(2)阔角炭角菌,共检测到63种物质,其中~1H-NMR 19种;GC-MS 51种,共同7种;(3)蚁巢,共检测到44种物质,其中~1H-NMR 18种;GC-MS 27种,共同1种;(4)鸡枞菌子实体,共检测到73种物质,其中~1H-NMR 31种;GC-MS 51种,共同9种;(5)鸡枞菌菌丝体,共检测到60种物质,其中~1H-NMR 26种;GC-MS 42种,共同8种。总体上两种方法互为补充,能检测到更多物质,且GC-MS强于~1H-NMR。6.分别对5种材料进行两两的差异物质分析,结果表明,对于同属物种,两种技术的分析结果趋向一致,如痂状炭角菌与阔角炭角菌比较组,基本呈现差异物质含量显著增加:在NMR方法分析出的11种显著差异物质中,10种差异物显著增加,GC-MS方法分析出的15种显著差异物质,皆显著增加;皱皮粗柄鸡枞菌菌丝体与子实体比较组,也基本呈现差异物质含量显著增加:在NMR方法分析出的12种显著差异物质中,9种显著上升,GC-MS方法分析出的17种显著差异物中,14种上升。对于不同属种,两种方法各有侧重,拉开了物种间的差异,如阔角炭角菌与蚁巢比较,NMR方法分析出的10种显著差异物中,8种显著增加的糖类中,7种为蚁巢特有,而GC-MS方法分析出的13种显著差异物中,13种皆显著下降,这13种物质中有8种是氨基酸类;皱皮粗柄鸡枞菌子实体与蚁巢比较,也呈相似的结果。以上结果表明两种方法联用的必要性和效用性。
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