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第一章结肠癌组织中RASGRF1的表达和甲基化检测目的探讨RASGRF1在结肠癌组织中的表达和甲基化情况及其与临床病理的关系。方法采用免疫组织化学和甲基化特异性PCR(MSP)检测结肠癌组织及其对应的远离结肠癌的正常组织RASGRF1蛋白表达情况和甲基化状态,分析RASGRF1蛋白的表达和启动子甲基化与临床病理参数的关系。结果1.在结肠癌组织中RASGRF1蛋白阳性表达率(36.8%)明显低于其对应的远端正常组织(91.2%),其蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)；与性别、年龄、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05)。2.在结肠癌组织中RASGRF1基因甲基化比例(70.6%)明显高于其对应的远端正常组织(17.6%),其甲基化程度与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)；与性别、年龄、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05)。3.RASGRF1在结肠癌组织中的表达与基因启动子甲基化呈负相关(P<0.05)。结论1. RASGRF1在结肠癌中表达下调,其表达与该基因启动子甲基化呈负相关,DNA甲基化可能是结肠癌RASGRF1表达下调的原因之一。2. RASGRF1在结肠癌组织中的表达及甲基化与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关,其表达下调和甲基化可能参与结肠黏膜的恶性转变,在结肠癌浸润转移中起一定的作用。第二章结肠癌细胞中RASGRF1的表达和甲基化检测及其过表达细胞模型的建立目的探讨RASGRF1在人结肠癌细胞株中的表达和甲基化情况,筛选适合的细胞株建立体外RASGRF1过表达细胞模型并对其进行验证。方法采用RT-PCR、Western Blot和MSP检测人结肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480和SW620中RASGRF1mRNA和蛋白的表达情况及甲基化状态；利用不同浓度的5-Aza-CdR处理结肠癌细胞,RT-PCR检测处理前后RASGRF1mRNA水平的表达变化；筛选出适合的细胞株建立体外RASGRF1过表达结肠癌细胞模型；将(?)IASGRF1过表达载体转染筛选出来的结肠癌细胞株,使结肠癌细胞高表达RASGRF1,并运用Real-time qPCR和Western Blot进行验证。结果1. RASGRF1mRNA在人结肠癌细胞株SW480中表达最高,HT29、SW620次之,而在HCT116中表达最低。2. RASGRF1蛋白在人结肠癌细胞株SW480中表达最高,而在HT29、HCT116和SW620中表达均明显下调。3. RASGRF1基因启动子在人结肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480和SW620中均存在不同程度的高甲基化,其中以HCT116甲基化程度最高。4.经过5-Aza-CdR处理后,结肠癌细胞HCT116中RASGRF1基因表达增高。5.选择HCT116细胞成功建立体外RASGRF1过表达细胞模型(pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO-RASGRF1)。结论1、RASGRF1mRNA和蛋白的表达在结肠癌细胞株HCT116中均明显下调,且RASGRF1基因启动子在结肠癌细胞株中存在高甲基化；5-Aza-CdR能上调RASGRF1的表达。2、HCT116细胞适于构建体外RASGRF1过表达细胞模型。pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO-RASGRF1能有效地转染HCT116细胞,使HCT116细胞中的RASGRF1高表达。第三章RASGRF1过表达对HCT116细胞生物学行为的影响及其机制的研究目的探讨RASGRF1过表达对人结肠癌细胞HCT116细胞生物学行为的影响及其机制。方法实验分为两组,转染pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO-RASGRF1的过表达组和转染空载体pcDNA3.2/V5/GW/D-TOPO的空白对照组。采用MTT法检测细胞增殖情况；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况；Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力；划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测细胞迁移能力；Western Blot法分析RASGRF1过表达对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标志物fibronectin, vimentin蛋白表达的影响。结果1.MTT结果显示,与空白对照组比较,过表达组可有效抑制HCT116细胞的生长和增殖能力(P<0.05)。2. Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术结果显示,空白对照组和过表达组HCT116细胞的早期调亡率分别为3.68±0.26%和4.18±0.25%；晚期凋亡率分别为23.90±0.38%和24.68±0.82%。过表达组与空白对照组相比,其早期和晚期凋亡率均无明显差异(P>0.05)。3. Transwell细胞侵袭实验显示,过表达组HCT116细胞穿膜数显著少于空白对照组(32.2±2.3vs.48.9±2.2)(P<0.01)。4.划痕实验结果显示,与空白对照组比较,过表达组HCT116细胞愈合能力明显减低；Transwell细胞迁移实验进一步证实,过表达组HCT116细胞穿膜数显著少于空白对照组(41.1±5.3vs.66.8±5.5)(P<0.01)。5. Western Blot结果显示,与空白对照组比较,过表达组E-cadherin蛋白的表达上调,而fibronectin, vimentin蛋白的表达下降。结论1. RASGRF1过表达可抑制HCT116细胞的生长和增殖,降低HCT116细胞的侵袭迁移能力,而对HCT116细胞的凋亡无明显影响,RASGRF1可能在调控结肠癌发生发展过程中起关键性作用。2. RASGRF1过表达可上调E-cadherin蛋白的表达,抑制fibronectin, vimentin蛋白的表达。RASGRF1可能通过阻滞EMT的发生抑制结肠癌侵袭和转移。