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目的:恶性肿瘤的基因扩增是细胞内基因拷贝数大量增加的异常现象,双微体(double minute chromosomes,DMs)是基因扩增的主要载体之一,双微体与肿瘤细胞的恶性程度、转移、预后和耐药性等有重要关系。人结直肠癌(CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一,结直肠癌的发生与基因改变密切相关。因此,本研究针对含有双微体的人结直肠腺癌NCI-H716细胞系,筛选双微体携带的高扩增基因,进一步研究恶性肿瘤双微体上携带的高扩增基因TRIB1在肿瘤细胞中的功能以及对双微体形成的作用,从而揭示新的与人结肠直肠癌发生和发展相关的基因,得到有临床价值的分子探针,有助于提供肿瘤细胞治疗的靶点,为新的治疗方式提供有价值的信息。
方法:利用SNP6.0芯片对含有双微体的NCI-H716细胞的基因组拷贝数进行分析,确定扩增子的染色体来源,进而筛选染色体上扩增区所含的基因。应用定量PCR方法对扩增子上的基因扩增情况及表达情况进行检测。运用荧光原位杂交方法进行定位,Western blot方法对TRIB1和NSMCE2基因在蛋白水平进行检测。利用RNA干扰技术使TRIB1基因表达沉默,进一步研究TRIB1基因功能及在双微体形成中的作用。
结果:对SNP6.0芯片结果分析得到了NCI-H716细胞的扩增子来源于8号染色体q24.12、q24.13、q24.21的3个扩增区(121034440~121537936、121999452~122552404、125541866~128978180)和10号染色体q26.13的1个扩增区(123172840~123617816),共包括15个基因。运用定量PCR对15个基因进行了DNA扩增水平及RNA表达水平的验证,结果发现9个高扩增高表达基因。查找基因相应功能,发现TRIB1和NSMCE2基因功能与肿瘤密切相关,蛋白水平检测到他们蛋白表达均增高。荧光原位杂交证实TRIB1基因所在区域位于双微体上,将TRIB1基因沉默后细胞遗传学研究发现双微体数量明显减少,细胞功能学研究检测到细胞增殖能力降低、侵袭能力降低及细胞周期发生变化等。
结论:人结肠直肠腺癌NCI-H716细胞中包含9个高扩增高表达基因,分别来源于8号染色体q24.12、q24.13、q24.21的3个扩增区和10号染色体q26.13的1个扩增区。其中TRIB1基因在人结肠癌细胞系NCI-H716中以双微体形式扩增,可以促进细胞增殖、增强细胞的侵袭能力。