研究背景Duchenne型／Becker型肌营养不良(DMD/BMD)是最常见的肌营养不良类型.致病基因为DMD基因。这一基因是迄今为止发现的人类最大基因,有多达79个外显子。同时DMD基因有多种致病突变类型,其中占全部突变30%微小突变,一直是临床基因诊断的难点。随着DNA测序技术、基因芯片技术的发展,己可利用全新技术平台,实现DMD基因微小突变的检测。研究目的建立基于目标序列捕获和高通量测序技术的平台用于检测DMD基因微小突变,并验证其敏感性和特异性。研究方法以2名经临床诊断、病理确诊且未发现DMD基因大片段缺失或重复的DMD患者(XZX、YZY)和1名经病理诊断排除DMD的肌病患者(CDY)为研究对象,在盲法原则下,分别完成DMD基因全部79个外显子的Sanger测序和基于目标序列捕获和高通量测序技术的新平台测序,对比两种检测方法的结果。同时,以YH标准gDNA确立了新平台的数据过滤法则。结果①经Sanger测序,发现患者XZX外显子22存在c.2833位单核苷酸C缺失；患者YZY外显子44存在c.6391-6392双核苷酸CA缺失；患者CDY未发现致病突变。②通过YH标准样本,确立"Ratio of Reads"=26.6%为用于检测的基因捕获芯片和高通量测序的最佳数据过滤法则。③经Targeted capture NGS平台,同样发现XZX外显子22存在c.2833位单核苷酸C缺失；患者YZY外显子44存在c.6391-6392双核苷酸CA缺失；患者CDY未发现致病突变。同时发现一些不致病SNP。④Target ed capture NGS测序与Sanger测序结果完全一致,是一种可供选择的DMD基因SNV检测方法。结论1、Targeted capture NGS检测平台,对DMD基因SNV和INDEL的检测,具有较高的敏感性、准确性。2、与经典Sanger测序相比,Targeted Capture NGS平台具有周期短、花费少、结果稳定的优势。研究背景Targeted capture NGS检测平台以往主要用于微小突变的检测。但通过精细操作和巧妙分析,是有可能用于基因CNV检测的。DMD为X连锁隐性遗传疾病,男性患者只有一条X染色体,更有利于通过测序深度分析来检测大片段缺失或重复。我们研究的同时,也有小样本回顾性研究将这一平台用于DMD基因的CNV检测。研究目的通过严格操作流程和后期程序化的生物信息学分析,将Targeted capture NGS检测平台用于DMD基因CNV检测,真正成为DMD/BMD患者基因诊断的常规手段。研究方法共有三组人群纳入研究：1、124名无家族遗传史的健康成年人(男性62名,女性62名),命名为健康对照组；2、41名DMD/BMD患者(男性40名,女性1名)以及8名先证者的无症状携带状态亲属(母亲或姐妹),命名为DMD组;3、245名DMD/BMD以外的其他单基因病患者(男性144名,女性101名),命名为non-DMD组。DMD组全部患者或携带者均经MLPA检测发现大片段缺失或重复。上述三组人群全部经Targeted Capture NGS检测平台检测,并通过公式计算标准化测序深度。健康对照组结果用来计算DMD基因每一外显子的标准化测序深度平均值和标准差。在盲法原则下,严格按计算公式和流程分析DMD组和non-DMD组的CNV情况。最后分析Targeted Capture NGS检测DMD基因CNV的敏感性和特异性。结果1、MLPA检测发现DMD组全部患者及携带者均存在大片段缺失或重复,并以这一结果为标准。2、健康对照组targeted capture NGS检测结果显示,DMD外显子男性测序深度约为女性测序深度的一半,结果均一性良好,标准差不大。3、通过targeted capture NGS平台CNV分析计算流程所得出的CNV结果具有良好的敏感性(99.26%)和特异性(99.99%)。结论1、利用创新性生物信息学分析方法,Targeted Capture NGS平台可用于DMD基因CNV检测,敏感性、特异性均良好。2、Targeted capture NGS检测平台更精确定位断裂点,可发现外显子部分缺失。研究背景Duchenne型肌营养不良从报道至今已有180余年历史,疾病的诊断经历了从临床诊断至基因确诊的不同阶段。自1987年Southern印迹杂交首先用于DMD基因诊断,先后出现多重PCR、MLPA、微阵列比较基因组杂交、Sanger测序等多种检测方法。这些方法各有优劣,但没有一种方法可以一次性全面检测DMD基因各种类型突变。利用目标序列捕获、高通量测序等最新分子生物学技术,我们建立了targeted capture NGS平台用于DMD/BMD的全方位基因诊断。研究目的验证全新targeted capture NGS平台在DMD/BMD实际临床检测中的有效性和可用范围。研究方法在近1年时间里,连续入组临床诊断DMD/BMD患者50名(男性48人,女性2人),其中4名先证者的母亲作为无症状携带者纳入研究。亦有6名先证者己死亡(生前仅临床疑诊,未基因确诊)家系中的可疑无症状女性携带者纳入研究,总入组人数60人。所有入组患者此前未明确基因诊断。入组受试者在targeted capture NGS平台进行全面基因检测,包括CNV和SNV。结果①50名受检患者中,共47人发现DMD基因致病突变,其中男性CNV7例、女性杂合CNV1例、男性SNV38例、女性杂合SNV1例。3人未检出致病突变,经肌肉活检免疫组化染色,其中1例证实为DMD,2例排除DMD。②4名先证者母亲均证实为相同突变的杂合携带者。6名无先证者家系可疑携带者中,3人发现为杂合大片段缺失携带者,3人未发现致病突变。③所有SNV均经Sanger测序证实,部分CNV重复MLPA证实。④首次系统报道了外显子部分缺失这一新突变亚型,共发现4个家系。结论1、Targeted capture NGS检测平台适用于DMD/BMD临床基因诊断,可一次性全面准确检测致病突变。具有准确、高效的特点。2、外显子部分缺失是一种新突变亚型,影响临床表型及未来的基因治疗。