【摘 要】
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天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)属于Ⅰ型植物核糖体失活蛋白(RibosomeInactivating Protein，RIP)，主要从药用植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)的块根和叶中提取出来，是一种抗滤过性病原体的植物防御蛋白。本研究应用转基因技术，以普通烟草品种K326和三生烟为外植体，将栝楼天花粉蛋白的突变基因TCS与Gus基因融合，通过根癌农杆菌介导
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天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)属于Ⅰ型植物核糖体失活蛋白(RibosomeInactivating Protein，RIP)，主要从药用植物栝楼(Trichosanthes kirilowii)的块根和叶中提取出来，是一种抗滤过性病原体的植物防御蛋白。本研究应用转基因技术，以普通烟草品种K326和三生烟为外植体，将栝楼天花粉蛋白的突变基因TCS<,A-S>与Gus基因融合，通过根癌农杆菌介导转化烟草，获得了含有目标基因插入序列的烟草转化体，通过分子生物学验证、细胞学检测以及抗病性试验，研究TCS基因的氨基酸序列、结构、功能及其抗病性机制。主要研究结果如下：
1、采用叶盘法，通过根癌农杆菌介导将含有TCS<,A-S>基因的双元载体pCambia1301/3132-1转化烟草，在25mg/L潮霉素的筛选条件下，K326和三生烟的转化率分别达到55.9％和72.4％，不含有TCS<,A-S>基因的空白载体pCambia 1301的转化率达到75.2％。
2、根据突变基因TCS<,A-S>基因序列设计特异引物，对12株烟草转化体进行PCR扩增，获得含有目标序列、长度为819bp的扩增片段。转化载体DNA和扩增产物DNA测序表明，插入基因的核苷酸序列没有发生碱基的改变。X-gluc的组织化学法染色，均能检测到Gus基因在转基因植株的根、茎、叶中的表达。表明TCS<,A-S>与Gus融合基因已成功转入烟草的基因组中，其编码蛋白116和161位点的突变并不影响基因整合和表达。
3、对Gus染色组织进行石蜡切片，镜检结果表明，含有TCS<,A-S>基因的pCambia1301/3132-1转化植株中，TCS<,A-S>与Gus基因的融合蛋白主要在叶片组织中的气孔、皮层的薄壁细胞及表皮毛顶端获得表达。表明烟草转化体中突变基因TCS<,A-S>的表达产物具有一定的细胞特异性，其编码蛋白的前导序列对于蛋白产物在细胞中的分布具有一定的影响。
4、病毒接种试验结果表明，含有TCS<,A-S>基因的pCambia 1301/3132-1烟草转化植株、不含有TCS<,A-S>基因的pCambia 1301烟草转化植株以及对照K326植株，在接种TOMV和CMV以后，均表现出系统花叶的感病症状。接种植株的SDS-PAGE电泳显示，感病植株能够分离出ToMV和CMV的外壳蛋白。因此，TCS基因编码蛋白116和161位点氨基酸的突变，导致烟草转化植株失去了对病毒ToMV和CMV的抗病性--说明TCS蛋白116和161位点的氨基酸涉及该蛋白对病毒的特异抗性。
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