糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是由肾上腺皮质束状带细胞分泌的一种类固醇(甾体)激素,是机体内极为重要的一类调节分子,它对机体的发育、代谢等起着重要调节作用,也是临床上使用广泛的抗炎、抗过敏和免疫抑制剂。其生理功能包括对糖、蛋白质和脂肪代谢的调节、对循环系统功能的调节、对免疫系统功能的调节等。在机体遇到强烈应激刺激时,糖皮质激素分泌迅速增多,增强机体对有害刺激的·抵抗力,维持器官、组织的正常功能活动。因此,糖皮质激素被称为应激反应的枢纽。除生理功能外,糖皮质激素还在临床上广泛应用,发挥抗炎、抗休克、抗过敏及免疫抑制等药理作用。糖皮质激素的药用剂量远远超过其生理剂量,二者产生的效应也不完全一致,作用机制更是多种多样,从而引起人们对糖皮质激素作用机制的深入探索。糖皮质激素作用机制的研究一直是生命科学领域的研究热点之一,并具有重要的理论意义和应用价值。既往普遍认为,糖皮质激素是在与其胞内(核)受体结合后,启动并调控相关基因的表达及蛋白质的合成,通过基因组机制实现其生理药理功能,此即经典的基因组机制。其特点是应答时间较长,通常在三十分钟以上,甚至长达数小时、数日。但近年来的研究发现,糖皮质激素还存在不依赖基因组途径的其它作用,称之为非基因组作用,其特点为：作用快、恢复快；偶联大分子的糖皮质激素仍然发挥作用；不能被糖皮质激素核受体拮抗剂、基因转录/蛋白合成抑制剂所阻断。上述非基因组作用包括：特异性作用机制,即通过受体介导,非特异性作用机制,即通过与细胞膜蛋白或脂质非特异性结合,改变细胞膜的理化特性(如流动性)或某些膜蛋白的微环境以发挥效应。糖皮质激素主要作为抗过敏、抗炎药物和免疫抑制剂广泛应用于临床,在对一些过敏性疾病和抑制炎症的治疗中,糖皮质激素是目前最常用、最有效的药物之一。在免疫细胞中,肥大细胞作为过敏反应的原发效应细胞之一,其在被抗原激活特定信号转导通路后,不仅脱颗粒分泌炎性介质,还分泌相当数量的多种细胞因子,在过敏性疾病的发生和发展中起着关键性的作用。前期研究已证实,糖皮质激素及其衍生物能够快速抑制豚鼠过敏性哮喘反应；糖皮质激素能够在短时间内快速抑制肥大细胞脱颗粒且糖皮质激素受体阻断剂及蛋白合成抑制剂不能阻断其效应。本课题合成了疏水性糖皮质激素衍生物并与原合成的亲水性糖皮质激素衍生物作对照,以肥大细胞为研究对象,旨在进一步探讨糖皮质激素快速抑制肥大细胞脱颗粒的分子机制。由此,本课题进行了以下研究：1、糖皮质激素衍生物的合成和鉴定：以氢化可的松为原料,苯丙氨酸为载体,与氢化可的松的21位羟基偶联,合成氢化可的松-21-苯丙氨酸酯盐酸盐(HP),并采用核磁共振氢谱和质谱对糖皮质激素衍生物进行结构鉴定。以快速抑制中性粒细胞脱颗粒为指标,对前期合成的系列糖皮质激素衍生物进行初筛,确定以氢化可的松-21-甘氨酸酯盐酸盐(HG)为样本,研究糖皮质激素衍生物对肥大细胞脱颗粒的影响及其机制。2、新型糖皮质激素对肥大细胞脱颗粒的影响：建立体外抗原激发肥大细胞脱颗粒模型,以荧光法检测组胺释放,研究糖皮质激素衍生物在不同剂量、不同时间对肥大细胞脱颗粒的影响。3、糖皮质激素及其衍生物对肥大细胞脱颗粒作用的分子机制：应用荧光偏振法检测肥大细胞胞膜流动性,应用Western Blotting方法检测抗原激发肥大细胞脱颗粒时Syk、Erk蛋白磷酸化的水平,探讨糖皮质激素对肥大细胞脱颗粒作用的可能机制。4、糖皮质激素衍生物对抗原刺激肥大细胞脱颗粒过程中肥大细胞胞内cAMP水平的影响：应用放射免疫测定法检测了糖皮质激素衍生物对肥大细胞中cAMP水平的影响。5、糖皮质激素及其衍生物对肥大细胞核内GRE基因的激活测定：肥大细胞转染了MMTV-luc之后,应用双荧光素酶报告基因检测系统检测糖皮质激素及其衍生物孵育不同时间之后对核内GRE基因的激活情况。主要研究结果如下：1、合成了疏水性糖皮质激素衍生物氢化可的松-21-苯丙氨酸酯盐酸盐(HP),采用核磁共振氢谱和质谱方法鉴定,结果表明合成的糖皮质激素衍生物结构及分子式正确。2、在体外抗原激发肥大细胞脱颗粒模型上,氢化可的松-21-甘氨酸酯盐酸盐(HG)预孵育可以剂量依赖性的快速抑制抗原激发的肥大细胞组胺释放,且作用与传统糖皮质激素无差异,并且这种作用不能被糖皮质激素经典胞内受体拮抗剂(RU38486)和蛋白合成抑制剂(放线菌酮)阻断,结果表明该作用中非基因组机制的存在；同时,糖皮质激素衍生物对组胺释放的抑制作用还具有明显的时间特征。3、糖皮质激素可以剂量依赖性的快速升高肥大细胞的细胞膜微黏度,降低膜流动性,并且这种作用不能被RU38486阻断,结果提示有类似经典糖皮质激素受体样结构在糖皮质激素快速影响肥大细胞膜流动性的中发挥作用4、糖皮质激素及其衍生物可以快速抑制抗原激发肥大细胞脱颗粒时Syk的磷酸化,且不能被RU38486和放线菌酮阻断。Syk特异性拮抗剂Piceatannol和糖皮质激素均能快速抑制抗原激发的组胺释放,提示胞内Syk(蛋白酪氨酸激酶磷酸化)是糖皮质激素快速抑制肥大细胞脱颗粒非基因组信号转导通路中的关键步骤。糖皮质激素及其衍生物可以快速抑制抗原激发肥大细胞脱颗粒时ERK的磷酸化,且不能被RU38486阻断,提示ERK蛋白可能是糖皮质激素基因组机制与非基因组机制交互作用的关键蛋白之一。5、糖皮质激素衍生物对抗原刺激肥大细胞脱颗粒过程中肥大细胞胞内cAMP水平无影响。,说明糖皮质激素衍生物快速抑制肥大细胞脱颗粒不涉及G蛋白偶联受体这条途径。6、传统糖皮质激素氢化可的松预孵育不同时间可以在15min之后检测到GRE活性,而糖皮质激素衍生物预孵育30min之内均不能检测到其活性,说明糖皮质激素衍生物不能在短时间内激活核内GRE基因,其快速作用不涉及到基因组机制。虽然GC作为免疫抑制剂、抗过敏和抗炎药物广泛应用于临床,但长期使用易引起严重并发症。如2002年爆发流行的SARS疫情中,大部分患者使用了不同剂量及疗程的GC制剂。尽管GC在SARS治疗中确实起到了缓解病情的作用,然而其使用后出现的诸多不良反应,包括早期的血糖增高、低血钾、低血钙、高血压,后期肾上腺皮质功能功能紊乱,严重继发感染,骨坏死等。对糖皮质激素非基因组作用机制的阐述,可以指导我们合成亲水性的糖皮质激素衍生物,使其不进入胞内与经典的糖皮质激素受体结合从而减小通过传统基因组机制引起的副作用,而仍然可以通过非基因组机制起效发挥临床效应。本课题对糖皮质激素快速抑制肥大细胞脱颗粒提供一个新的分子机制,即通过快速非基因组机制降低膜流动性,快速影响抗原激发肥大细胞脱颗粒时上游Syk及ERK蛋白的磷酸化水平,进而抑制肥大细胞炎性介质的释放,而且亲水性的糖皮质激素衍生物能够在30分钟内快速抑制肥大细胞组胺释放但是不能快速影响胞内cAMP水平。亲水性糖皮质激素衍生物在30min内不能激活核内GRE基因。因此,本项目中糖皮质激素衍生物的合成为糖皮质激素的临床应用和新产品开发提供了新的策略,有助于寻找新的激素替代品,减少副作用,从而将糖皮质激素快速非基因组机制研究从基础理论研究扩展到了应用领域。