论文部分内容阅读
糖苷磷酸化酶(GPs)是一类能够可逆性催化糖苷键形成和断裂的酶，这类酶结合了糖苷水解酶(GHs)和糖基转移酶(GTs)的双重功能，可以进行单糖的水解和转移。其独特的可逆性反应优势，与底物专一性结合。和使用稳定的糖磷酸为供体这些特点，使得磷酸化酶在合成各种结构得碳水化合物中成为重要的催化剂，尤其是在寡糖的合成过程中，使用1-磷酸糖作供体，将其添加到特定的糖受体上。基于这一概念，利用GPs，可以以自然中广泛分布的糖为原料合成更昂贵的二糖产物，或在某些情况下，某个底物特异性不强的磷酸化酶可以轻松地进行低聚寡糖的合成。与糖苷水解酶和糖基转移酶相比，对GPs的研究还很缺乏。近年来，研究发现磷酸化酶具有合成很多种复杂的糖苷类化合物的能力。
本研究从9种细菌中克隆得到16个基因，并对这16个基因进行原核重组表达和蛋白纯化，酶活性测试发现其中2个酶具有最高的酶活性，分别为GH130家族的甘露糖苷磷酸化酶和GH65家族的麦芽糖磷酸化酶。酶学功能研究发现，甘露糖苷磷酸化酶具有显著的合成β-1，3甘露糖苷的功能，且可以进行低聚寡糖合成。本研究还利用GPs转移磷酸糖的特点，探讨了两个酶以不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖苷(X-sugars)为糖受体，分别以α-1-磷酸甘露糖和β-1-磷酸葡萄糖为供体，合成了X-糖苷类化合物。
1.新型磷酸化酶的筛选:基因克隆、重组表达、和重组蛋白质的纯化
从多种假定基因中，通过蛋白质同源序列比对，筛选潜在基因，是寻找新型活性酶的典型方法。本章用一个已被鉴定的GP为模板，通过蛋白质同源序列比对，从多种微生物中找到了的36个假定基因，通过pGH克隆载体，扩增基因片段，最终将基因连接到pET30a表达载体上，最终重组表达蛋白通过大肠杆菌BL21细胞进行表达。共有16个基因被成功克隆，并进行重组表达。表达的蛋白通过Ni2+-次氯基三乙酸酯琼脂糖亲和层析柱纯化。对纯化得到的蛋白质进行酶活检测在以下章节。
2.新型β-1，3-甘露糖磷酸化酶的发现生化特性测定
糖苷酶GH130家族是最近在CaZy数据库中成立的。该家族的成员催化生成共同的产物即α-1-磷酸甘露糖，同时也可以将α-1-磷酸甘露糖上的甘露糖转移至糖受体上。在此，首次报道一种从海洋黄杆菌属细菌Zobellia galactanivorans中克隆得到的GH130家族的新型酶。该酶具有独特的β-1，3甘露聚糖合成活性，可以利用多种糖受体进行合成。此外，利用该酶转移磷酸糖的特点，可以生成各种二糖、寡糖以及吲哚酚糖(X-sugars)。对合成的吲哚酚二糖(X-Man-man和X-GlcNAc-man)纯化后进行NMR结构分析，结果表明产物中连接甘露糖和其他糖受体的均为β-1，3-甘露糖苷键。这种生成特定键型的特点为提供了一种新的催化工具，可用于合成未知的糖苷类化合物。
3.利用Emticicia oligotrophica源麦芽糖磷酸化酶合成吲哚酚糖类物质
麦芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)利用无机磷酸盐催化麦芽糖生成β-1-磷酸葡萄糖和葡萄糖，该反应为可逆反应。本章，首次描述了利用麦芽糖磷酸化酶合成不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖双苷类物质。麦芽糖磷酸化酶基因是从细菌E.oligotrophica中分离出来的，该酶对麦芽糖具有较高的磷酸化选择性，而使用其他含葡萄糖的二糖如纤维二糖，蜜二糖，蔗糖，海藻糖时均没有磷酸化现象发生。此外，以不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖苷(X-sugars)为糖受体，β-1-磷酸葡萄糖为供体，合成X-糖苷类化合物来评估的麦芽糖磷酸化酶的底物特异性，生成的产物用LC-ESI-MS和MALDITOF-MS来检测。本实验还以廉价的麦芽糖为原料合成含有葡萄糖的糖苷类化合物.结果表明该麦芽糖磷酸化酶具有重要的商业应用价值。
本研究从9种细菌中克隆得到16个基因，并对这16个基因进行原核重组表达和蛋白纯化，酶活性测试发现其中2个酶具有最高的酶活性，分别为GH130家族的甘露糖苷磷酸化酶和GH65家族的麦芽糖磷酸化酶。酶学功能研究发现，甘露糖苷磷酸化酶具有显著的合成β-1，3甘露糖苷的功能，且可以进行低聚寡糖合成。本研究还利用GPs转移磷酸糖的特点，探讨了两个酶以不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖苷(X-sugars)为糖受体，分别以α-1-磷酸甘露糖和β-1-磷酸葡萄糖为供体，合成了X-糖苷类化合物。
1.新型磷酸化酶的筛选:基因克隆、重组表达、和重组蛋白质的纯化
从多种假定基因中，通过蛋白质同源序列比对，筛选潜在基因，是寻找新型活性酶的典型方法。本章用一个已被鉴定的GP为模板，通过蛋白质同源序列比对，从多种微生物中找到了的36个假定基因，通过pGH克隆载体，扩增基因片段，最终将基因连接到pET30a表达载体上，最终重组表达蛋白通过大肠杆菌BL21细胞进行表达。共有16个基因被成功克隆，并进行重组表达。表达的蛋白通过Ni2+-次氯基三乙酸酯琼脂糖亲和层析柱纯化。对纯化得到的蛋白质进行酶活检测在以下章节。
2.新型β-1，3-甘露糖磷酸化酶的发现生化特性测定
糖苷酶GH130家族是最近在CaZy数据库中成立的。该家族的成员催化生成共同的产物即α-1-磷酸甘露糖，同时也可以将α-1-磷酸甘露糖上的甘露糖转移至糖受体上。在此，首次报道一种从海洋黄杆菌属细菌Zobellia galactanivorans中克隆得到的GH130家族的新型酶。该酶具有独特的β-1，3甘露聚糖合成活性，可以利用多种糖受体进行合成。此外，利用该酶转移磷酸糖的特点，可以生成各种二糖、寡糖以及吲哚酚糖(X-sugars)。对合成的吲哚酚二糖(X-Man-man和X-GlcNAc-man)纯化后进行NMR结构分析，结果表明产物中连接甘露糖和其他糖受体的均为β-1，3-甘露糖苷键。这种生成特定键型的特点为提供了一种新的催化工具，可用于合成未知的糖苷类化合物。
3.利用Emticicia oligotrophica源麦芽糖磷酸化酶合成吲哚酚糖类物质
麦芽糖磷酸化酶(EC2.4.1.8)利用无机磷酸盐催化麦芽糖生成β-1-磷酸葡萄糖和葡萄糖，该反应为可逆反应。本章，首次描述了利用麦芽糖磷酸化酶合成不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖双苷类物质。麦芽糖磷酸化酶基因是从细菌E.oligotrophica中分离出来的，该酶对麦芽糖具有较高的磷酸化选择性，而使用其他含葡萄糖的二糖如纤维二糖，蜜二糖，蔗糖，海藻糖时均没有磷酸化现象发生。此外，以不同的5-溴-4-氯-3-吲哚糖苷(X-sugars)为糖受体，β-1-磷酸葡萄糖为供体，合成X-糖苷类化合物来评估的麦芽糖磷酸化酶的底物特异性，生成的产物用LC-ESI-MS和MALDITOF-MS来检测。本实验还以廉价的麦芽糖为原料合成含有葡萄糖的糖苷类化合物.结果表明该麦芽糖磷酸化酶具有重要的商业应用价值。