论文部分内容阅读
成牙本质细胞是位于牙髓组织最外层的高柱状细胞，顶端能够分泌牙本质基质，底端位于牙髓组织内，是一种典型的极性化细胞。在成牙本质细胞的发生过程中，经历了从无极性化细胞分化发育成为极性化细胞的过程。该过程的进行同时也伴随着成牙本质细胞的成熟与牙本质基质的分泌。在细胞顶底极性建立过程中，细胞连接的形成和极性蛋白复合物的定位是两个必要的细胞生物学行为。细胞连接作为相邻细胞间的锚定结构，起到阻隔外来物质通透细胞层的作用，同时作为细胞膜分隔条带，将细胞膜区域分为顶端和底端。细胞连接的建立也为细胞极性复合物在细胞膜上的定位提供了锚定结构，是细胞极性形成的前提。细胞极性复合物的发生及其在细胞膜特定区域的定位则是细胞极性形成的分子基础。极性分子在细胞膜的定位决定了细胞膜相应区域的功能。同时，细胞连接的建立和极性分子的定位也可以影响细胞器在胞浆内的分布。发育成熟的成牙本质细胞，其细胞核位于细胞的底端，内质网、高尔基体等细胞器则朝向细胞的分泌端，即细胞顶端。这种细胞形态的形成正是其细胞极性化分泌功能的形态学基础。本课题采用多种分子生物学方法证实了与成牙本质细胞极性建立密切相关的部分蛋白的表达，并对其功能进行了初步探讨，以期为相关研究提供一定的基础。1．成牙本质细胞部分极性蛋白的表达提取小鼠牙髓组织和OLCs细胞的总RNA和总蛋白后，用PCR检测cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA的表达，用western blot检测cdc42蛋白的表达。OLCs细胞经固定、脱水、通透后，用细胞免疫荧光检测cdc42在OLCs中的表达定位。出生后2周小鼠及出生前14天、16天、18天胚胎小鼠经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片后，用组织免疫荧光检测cdc42在牙胚发育过程中的表达。结果显示，cdc42、ZO-1、occludin、claudin-1、E-cadherin mRNA及cdc42蛋白在牙髓组织和OLCs中皆有表达。在OLCs细胞膜和细胞浆中，cdc42皆有表达并且在细胞核周围表达量明显高于其他部位。在牙胚发育过程中，cdc42参与了成牙本质细胞极性化的发生过程。2．成牙本质细胞细胞连接的体外建立及其与LPS的关系OLCs接种于含有α-MEM培养液的transwell小室中培养两周后，通过扫描电镜观察细胞排列状态，通过透射电镜观察细胞间连接的建立。OLCs接种于6孔板中，各组培养液中加入不同浓度LPS（10ng/ml、100ng/ml、和1000ng/ml），以条件培养液（10ng/ml LPS）中同时加入NF-κB抑制剂PDTC和LPS组作为对照；分别培养0.5h、1h、2h、6h，各时间点采用Western blot观察细胞连接蛋白E-cadherin在蛋白水平的变化；以实时定量PCR观察细胞连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin在mRNA水平的改变。结果显示，经过立体培养的OLCs细胞间形成了明显的细胞连接。经过LPS处理后，ZO-1、occludin、claudin-1和E-cadherin的mRNA表达水平明显降低，且在一定的作用时间范围内呈明显的时间依赖性，但与浓度（10-1000ng/ml）无明显依赖性。同时，E-cadherin在蛋白水平随着LPS作用时间的延长其表达水平逐渐降低，而NF-κB抑制剂PDTC时能够抑制这种效应。3．cdc42与牙源性细胞矿化的关系OLCs细胞接种培养至融合80%后，实验组分别更换为矿化诱导液、含10ng/mlLPS的α-MEM培养液和含10ng/ml LPS矿化诱导液经一定时间培养后，通过westernblot测定其中cdc42含量的变化；矿化诱导液组和含ML141的矿化诱导液组培养一定时间后，通过茜素红染色观察矿化结节形成情况并进行定量分析。HDPSCs在含不同浓度LPS的矿化诱导液和含不同浓度ML141的矿化诱导液中培养一定时间后，通过茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析。Western blot结果显示，OLCs中cdc42的表达在矿化诱导液的作用下未发生明显改变，在LPS作用下明显上调。茜素红染色结果显示，OLCs矿化结节的形成量与时间正相关，与ML141的浓度呈负相关；HDPSCs矿化结节的形成与LPS浓度正相关，与ML141浓度负相关。