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上世纪发现抗菌抗生素以来,细菌性疾病已经得到有效控制,此为寻找抗病毒抗生素提供了研究途径。本研究就是在获得一株可产生抗病毒活性成分的基础上,进行了有效成分的提取分离纯化,并进行了抗病毒谱、抗病毒机制的初步研究。
[目的]分离、确定真菌发酵物中的抗病毒成分,初步探讨抗病毒谱。
[方法]
1抗病毒活性物质的分离:用丙酮/乙酸乙酯提取、旋转蒸发从发酵菌丝中获取酯相,然后过硅胶柱,用石油醚和乙酸乙酯混合液洗脱(洗脱梯度为15∶1、12∶1、10∶1、8∶1),分部收集洗脱液,旋转蒸干后测定抗病毒活性,然后将活性组分通过HPLC制备分离单峰化合物和混合峰组分,然后将单峰物质做紫外光谱、质谱、核磁共振炭谱和氢谱分析。
2抗病毒谱的初步探索:用体外抗病毒试验方法将硅胶柱石油醚/乙酸乙酯(10∶1)洗脱组分(简称柱洗脱组分)与单峰化合物做多科病毒的体外抑毒试验,病毒包括:疱疹科病毒(HCMV、HSV-1、HSV-2)、副粘病毒科病毒(RSV)、腺病毒(Ad3)、肠道病毒(COXB1-6)、弹状病毒科病毒(VSV)、呼肠孤病毒科病毒(轮状病毒,RVAS11)、正粘科病毒(流感甲地方株、流感乙地方株)15株病毒。
3抗病毒机制的初步探讨:
①探讨柱洗脱组分和jn219是在病毒哪个复制周期外使病毒丧失感染能力(用HCMV作为测活依据):首先将药物与病毒在37℃作用1h后、与病毒同时、病毒感染1h使病毒完成穿入过程后接种药物到多孔板细胞上,根据细胞病变判断药物作用效果;
②在初步确定药物在细胞外即可使病毒丧失感染能力的基础上,将紫外线灭活的病毒与药物作用后,观察灭活的病毒是否竞争了药物的抗病毒活性。
4纯化合物jn219抗病毒活性稳定试验:将jn219存放于4℃,30d后做抗病毒试验,通过与存放前测定结果的比较,探讨其抗病毒活性的稳定性。
[结果]
1抗病毒活性物质的分离:真菌产物用丙酮/乙酸乙酯分离成水相和酯相,活性测定发现两相中均有显著抗病毒活性,鉴于酯相分离简便,故选择酯相做进一步分离。首先用硅胶柱分离,发现在石油醚/乙酸乙酯之10/1提取相(简称柱洗脱组分)具有高效抗病毒活性,用制备型高压液相色谱进一步分离,获得一单峰物质(命名为jn219,)和数个混合峰组分(分别编号1、2、3、4号)。jn219紫外吸收高峰在220nm,质谱分析其分子量为519道尔顿,活性跟踪发现jn219和混合峰组分1号均有抗病毒活性。
但核磁共振炭谱和氢谱化学移位杂乱,不能计算出炭氢数目,未能推测出分子结构。
2抗病毒谱的初步探讨:通过抑毒试验,证明柱洗脱组分和jn219对HCMMV、VSV、RV具有良好的抗病毒活性,而对HSV-1、HSV-2、RSV、有弱抗病毒活性,对AD3、COX-B1-6无显著抗病毒效果。
3抗病毒机制的初步探讨:柱洗脱组分和jn219与毒液细胞外作用1h后可使HCMV丧失感染能力,而先将jn219接种细胞然后用病毒攻击则不能全部抑制HCMV病变的发生;并且紫外灭活的HCMV可竞争抑制柱洗脱组分和jn219的抗病毒活性,表明柱洗脱组分和jn219的抗病毒作用主要与阻断HCMV的穿入、融合过程有关。
4纯化合物jn219抗病毒活性稳定试验:jn21930d前半数有效浓度为0.4ug/ml储存30d后半数有效浓度为39.7ug/ml,与储存前比较,30d活性降低99.25倍。
[结论]
1获取真菌代谢产物抗病毒有效组分和纯化合物jn219;
2探索了分离提纯jn219的方法,为大量提取奠定基础;
3初步探讨了有效组分和jn219的抗病毒谱,表明有效组分和jn219具有较广的抗病毒谱;
4初步探讨了抗病毒机制,并初步认为其抗病毒作用位点主要是阻断病毒入侵宿主细胞;
5炭谱氢谱分析化学移位杂乱,无法计算,未能推算分子结构。
6储存后jn219抗病毒活性有下降,稳定性待探讨。