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结直肠癌是现今社会中备受关注的一大恶性消化道肿瘤,其死亡率与发病率逐年升高。目前临床治疗手段仍然以手术和放化疗为主。近些年来,PD-1/PD-L1抗体治疗进入临床应用,但在实际应用中由于应答率低和副作用较大而受到一定的限制。肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过其自身携带的蛋白质、m RNA、非编码RNA和脂质等物质,调控肿瘤微环境和机体免疫系统,从而干预肿瘤进程。前期研究数据已经证实结直肠癌细胞系高表达免疫抑制分子TIGIT及其配体CD155,而miR206能靶向下调TIGIT。因此本课题通过构建富含miR206的肿瘤细胞来源外泌体,靶向下调TIGIT,通过FAK-SRC和PI3K-AKT信号通路调节结直肠癌细胞和免疫细胞的生物学功能,从而抵抗结直肠癌的进展。第一部分LV-miR206-HT29-EXO的制备与生物学鉴定目的获取富含miR206的结直肠癌细胞HT29来源的外泌体并鉴定其生物学特性。方法构建高表达miR206的结直肠癌细胞HT29,分离培养上清中的外泌体,并鉴定其生物学特性。1.利用构建成功的miR206慢病毒载体转染结直肠癌细胞HT29,q RT-PCR检测结直肠癌细胞HT29转染前后miR206表达水平,Western Blot检测结直肠癌细胞HT29转染前后TIGIT和CD155蛋白表达水平;2.利用超速离心法分离提取转染前后结直肠癌细胞HT29培养上清中的外泌体,Western Blot检测外泌体中TIGIT和CD155蛋白表达水平;3.透射电镜检测外泌体的形态结构,粒径追踪技术分析外泌体粒径大小,WesternBlot检测外泌体标志蛋白的表达。结果1.qRT-PCR结果显示:相比于转染前,转染后的细胞及其分泌的外泌体均高表达miR206。Western Blot结果显示:转染miR206后,细胞及其分泌的外泌体中TIGIT和CD155的表达均显著下调,以TIGIT下调尤为明显。2.透射电镜下观察到分离的外泌体呈典型的“茶杯状”,具有双层膜结构。马尔文粒径分析仪追踪到外泌体平均粒径180nm。Western Blot检测到常见的三种外泌体标记蛋白CD9、CD63、CD81。结论成功获取了符合外泌体生物学特征的LV-miR206-HT29-EXO。第二部分LV-miR206-HT29-EXO在结直肠癌中的作用效果研究目的明确LV-miR206-HT29-EXO对结直肠癌细胞和免疫细胞生物学功能的影响以及在结直肠癌小鼠体内的作用效果。方法利用已获取的LV-miR206-HT29-EXO与结直肠癌细胞和Jurkat T细胞共培养,探究LV-miR206-HT29-EXO体外作用效果。采用AOM/DSS方法建立结直肠癌小鼠模型,探究LV-miR206-HT29-EXO在结直肠癌小鼠体内作用效果。1.外泌体与结直肠癌细胞共培养,采用CCK8实验优化其适宜的作用浓度和作用时间;2.外泌体、Anti-TIGIT和Anti-PD1与结直肠癌细胞HT29、SW620共培养,划痕实验检测结直肠癌细胞HT29、SW620体外迁移能力,Transwell实验检测结直肠癌细胞HT29、SW620体外侵袭能力,流式细胞术检测结直肠癌细胞HT29、SW620体外凋亡能力,CCK8实验检测结直肠癌细胞HT29、SW620体外增殖能力;3.外泌体、Anti-TIGIT和Anti-PD1与Jurkat T细胞共培养,CCK8实验检测Jurkat T细胞体外增殖能力,流式细胞术检测Jurkat T细胞体外凋亡能力;4.建立C57BL/6J小鼠结直肠癌模型:AOM/DSS三步循环法诱导4-6周龄的C57BL/6J小鼠,构建小鼠结直肠癌模型。AOM剂量为10mg/kg,行单次腹腔注射,一周后,用含2%DSS的饮用水饲喂五天,换正常饮水两周,随后再次使用含2%DSS的饮用水五天,如此共三次循环;5.外泌体于AOM注射后第二天行灌胃干预,两天一次,16周后结束。评估小鼠生存率,肿瘤体积和肠组织损伤程度;6.标本采集与处理:处死小鼠后,解剖收集结直肠组织,采集肠内粪便于冻存管中,置液氮罐中储存备用测序。游标卡尺测量记录肿瘤体积。取肿瘤组织行组织学检测。结果1.CCK8结果显示:肿瘤外泌体LV-miR206-HT29-EXO对结直肠癌细胞活力的抑制呈剂量依赖性和时间依赖性,且显著促进Jurkat T细胞增殖。划痕实验结果显示:相比于NC组,LV-Vector-HT29-EXO组、LV-miR206-HT29-EXO组以及抗体组都抑制了结直肠癌细胞体外迁移能力,LV-miR206-HT29-EXO组与Anti-PD1组无统计学差异。Transwell实验结果显示:相比于NC组,LV-Vector-HT29-EXO组、LV-miR206-HT29-EXO组以及抗体组都抑制了结直肠癌细胞的体外侵袭能力,LV-miR206-HT29-EXO组效果与Anti-TIGIT和Anti-PD1无统计学差异。流式细胞术结果显示:相比于NC组,LV-Vector-HT29-EXO组、LV-miR206-HT29-EXO组以及抗体组都促进了结直肠癌细胞凋亡。相比于NC组,LV-miR206-HT29-EXO组对Jurkat T细胞凋亡无显著影响,而Anti-TIGIT和Anti-PD1显著抑制其凋亡,有统计学差异。2.体内实验结果显示:相比于结直肠癌小鼠,LV-miR206-HT29-EXO干预后的小鼠肠壁内肿瘤体积显著减小。LV-miR206-HT29-EXO组生存率明显优于对照组,LV-miR206-HT29-EXO的干预提升了结直肠癌小鼠生存率。相比于结直肠癌小鼠,LV-miR206-HT29-EXO干预使得结直肠癌小鼠肠组织破坏减轻,LV-Vector-HT29-EXO效果次之。结论1.LV-miR206-HT29-EXO能促进结直肠癌细胞HT29、SW620发生凋亡,抑制其增殖、迁移和侵袭。2.LV-miR206-HT29-EXO能明显减缓结直肠癌的进展。第三部分LV-miR206-HT29-EXO在结直肠癌中的作用机制研究目的探讨LV-miR206-HT29-EXO在结直肠癌进展中的调控机制。方法LV-miR206-HT29-EXO与结直肠癌细胞共培养探究体外作用机制,分析结直肠癌小鼠体内免疫微环境变化。1.LV-miR206-HT29-EXO与结直肠癌细胞共培养后,Western Blot检测迁移侵袭相关蛋白SRC、FAK、ERK表达,细胞增殖和凋亡相关蛋白PI3K、AKT、BAX、BCL-2的表达;2.提取小鼠脾脏单个核细胞,流式细胞术分析小鼠免疫细胞比例及其功能变化。结果1.Western Blot结果显示:相比于NC组和LV-Vector-HT29-EXO组,LV-miR206-HT29-EXO干预后,结直肠癌细胞中与细胞迁移和侵袭相关的蛋白SRC、FAK和ERK表达下调,与细胞增殖和凋亡相关的蛋白PI3K、AKT和BAX表达下调。2.流式细胞分析术结果显示:在结直肠癌小鼠脾脏免疫细胞中,NK细胞相比于正常小鼠,比例明显升高,且TIGIT表达水平增强,经LV-miR206-HT29-EXO干预后,NK细胞上TIGIT表达水平下降,NK细胞分泌细胞因子Perforin的能力趋于正常。巨噬细胞相比于正常小鼠,比例显著升高,经LV-Vector-HT29-EXO和LV-miR206-HT29-EXO干预后,巨噬细胞比例下降,有统计学差异。B细胞相比于正常小鼠比例有所下降,与结直肠癌小鼠相比,LV-miR206-HT29-EXO干预后,B细胞比例接近正常,而CD19+Ig G+的B细胞未有统计学差异。CD4+CXCR3+Th1细胞比例未有明显变化,IFN-γ水平降低,TIGIT表达上调,LV-Vector-HT29-EXO组和LV-miR206-HT29-EXO组中CD4+CXCR3+Th1细胞分泌IFN-γ水平升高,LV-miR206-HT29-EXO组细胞上TIGIT表达降低。CD4+CCR4+Th2细胞比例降低,IL-4水平升高,TIGIT表达上调,LV-Vector-HT29-EXO组和LV-miR206-HT29-EXO组CD4+CCR4+Th2细胞分泌IL-4水平显著降低,LV-miR206-HT29-EXO组CD4+CCR4+Th2细胞上TIGIT表达降低。CD4+CCR6+Th17细胞比例升高,IL-17水平明显升高,TIGIT表达上调,LV-Vector-HT29-EXO组和LV-miR206-HT29-EXO组CD4+CCR6+Th17细胞分泌IL-17水平显著降低,LV-miR206-HT29-EXO组CD4+CCR6+细胞上TIGIT表达降低。CD4+CXCR5+Tfh细胞比例明显降低,TIGIT表达上调,LV-miR206-HT29-EXO组CD4+CXCR5+Tfh细胞上TIGIT表达降低,趋于正常水平。CD8+TIGIT+细胞比例显著升高,LV-Vector-HT29-EXO组和LV-miR206-HT29-EXO组CD8+TIGIT+细胞比例降低,CD8+T细胞分泌细胞因子Granzyme B的能力显著提高。Treg细胞比例显著上升,分泌细胞因子IL-10的能力增强,且TIGIT表达水平明显增强,LV-miR206-HT29-EXO组TIGIT+Treg细胞比例明显下降,Treg细胞中IL-10的分泌水平也随之降低,趋于正常水平。结论LV-miR206-HT29-EXO通过靶向下调TIGIT,调控FAK-SRC和PI3K-AKT通路相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞生长,调节各类免疫细胞比例及其功能从而有效减缓结直肠癌的进展。