肥胖与2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、冠心病等多种代谢紊乱及慢性疾病发病风险密切相关,被世界卫生组织列为威胁人类健康的十大疾病之一。深入研究肥胖发病机制、寻找干预靶点对肥胖的防治非常重要。近年来的研究表明长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)在肥胖的发生发展中起着至关重要的作用。既往研究报道,lnc RNA SRA(steroid receptor RNA activator)是最先被发现能调节脂肪生成的一类lnc RNA,通过结合在PPARγ的启动子区域,促进其转录来影响脂肪生成。有研究显示,棕色脂肪高丰度表达的lnc RNA Blnc1(Brown fat lnc RNA 1,Blnc1)对棕色脂肪细胞的分化和产热基因的调控起着重要作用。我们前期研究发现Blnc1在白色脂肪组织中也有表达,然而Blnc1对白色脂肪线粒体生物合成和功能的作用尚不清楚。本研究拟通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型,采用附睾脂肪注射Blnc1过表达腺病毒的方式构建附睾脂肪特异性过表达Blnc1肥胖小鼠(HFD-Ad-Blnc1小鼠),观察Blnc1对肥胖小鼠的全身糖脂代谢的影响以及对附睾脂肪线粒体生物合成的作用。体外实验中,通过在3T3-L1前脂肪细胞中敲低或过表达Blnc1,观察Blnc1表达改变对线粒体的生物合成和功能的影响;并探讨Blnc1调控前脂肪细胞线粒体生物合成和功能的具体分子机制,为寻找治疗肥胖的潜在药物靶点提供实验依据。第一部分附睾脂肪特异性过表达Blnc1对高脂饮食诱导的肥胖小鼠的全身代谢的影响目的明确附睾脂肪特异性过表达Blnc1对高脂饮食诱导的肥胖小鼠全身糖脂代谢的影响,探讨其对附睾脂肪线粒体生物合成的作用。方法将5周龄健康雄性C57BL/6小鼠高脂饮食(HFD)喂养12周建立肥胖模型,将肥胖模型建立后的小鼠随机分为HFD-Ad-GFP组(n=5)和HFD-Ad-Blnc1组(n=5)。HFD-Ad-Blnc1组行双侧附睾脂肪多点注射Ad-Blnc1的腺病毒,HFD-Ad-GFP组注射阴性病毒。注射5周后,利用腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素敏感性试验(ITT)检测小鼠胰岛素抵抗状态。测量比较不同处理组小鼠的体重、脂肪组织和肝脏的重量;利用苏木精-伊红(H&E)染色观察附睾脂肪和肝脏组织的结构及脂质积累情况;采用线粒体染色、线粒体DNA拷贝数、实时荧光定量PCR(q PCR)和蛋白免疫印迹等技术,检测小鼠附睾脂肪的线粒体生物合成情况。结果1.与普通饮食组(NCD)相比,HFD喂养会显著增加小鼠体重(P<0.001),诱导胰岛素抵抗和糖耐量异常,增加肝脏脂质沉积,减少附睾脂肪线粒体的数量以及生物合成相关基因的表达水平(P<0.05)。2.与HFD-Ad-GFP组相比,Blnc1在HFD-Ad-Blnc1小鼠的附睾脂肪中特异性过表达(P<0.05),且附睾脂肪的重量显著减少(P<0.001)。3.肥胖小鼠附睾脂肪特异性过表达Blnc1后,血清脂联素水平显著升高,改善葡萄糖耐量和减轻胰岛素抵抗(P<0.05)。4.与HFD-Ad-GFP组相比,HFD-Ad-Blnc1小鼠的肝脏组织中的脂质沉积和甘油三酯含量明显降低(P<0.05)。肝脏脂联素受体及其下游的脂解基因(Pgc1α、Adipo R2、APPL1、Acadl,Aox,PPARα)的表达明显升高(P<0.05)。5.通过线粒体DNA拷贝数检测和线粒体染色,观察到肥胖小鼠过表达Blnc1后,附睾脂肪中的线粒体生物合成显著增加(P<0.05);且线粒体生物合成和功能的相关基因(Pgc1α,Pgc1β,Adiponectin,electron transport chain-ECT)的表达显著上调(P<0.05)。结论高脂饮食诱导的肥胖导致小鼠的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性,显著损害小鼠白色脂肪组织的线粒体生物合成。肥胖小鼠附睾脂肪过表达Blnc1后,通过部分逆转肥胖引起的白色脂肪线粒体生物合成损伤,增加血清脂联素水平,有效地缓解肥胖引起的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性。第二部分Blnc1对3T3-L1前脂肪细胞的线粒体生物合成和功能的作用目的我们在第一部分的研究中发现肥胖小鼠附睾脂肪特异性过表达Blnc1可明显改善了肥胖诱导的胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性,部分逆转肥胖引起的白色脂肪线粒体生物合成损伤,并推测其对线粒体功能有一定的修复作用。为了进一步明确Blnc1对白色脂肪线粒体生物合成和功能的作用,我们在3T3-L1前脂肪细胞中过表达或敲低Blnc1,观察Blnc1对于前脂肪细胞线粒体生物合成和功能的影响。方法用Blnc1-over腺病毒和Blnc1-KD慢病毒分别感染3T3-L1前脂肪细胞,过表达或敲低Blnc1;通过嘌呤霉素筛选建立Blnc1-KD稳转细胞系。采用线粒体染色和线粒体DNA拷贝数检测线粒体的数量;透射电镜下观察线粒体的形态;检测有氧呼吸速率(OCR)和ATP产生总量评估线粒体的功能;q PCR和western blot检测线粒体电子传递链复合物和生物合成的关键基因的表达情况。结果1.Blnc1-over腺病毒和Blnc1-KD慢病毒能够在3T3-L1前脂肪细胞中成功地过表达或敲低Blnc1(P<0.001),并构建了Blnc1-KD的稳筛3T3-L1前脂肪细胞系。2.在过表达Blnc1的3T3-L1前脂肪细胞中,线粒体染色加深,线粒体DNA拷贝数增加,电镜下线粒体内嵴增加以及线粒体生物合成相关基因(Pgc1α、Pgc1β、NRF1)表达上调(P<0.05)。线粒体功能方面,过表达Blnc1后,前脂肪细胞的线粒体电子传递链复合物的表达显著上调,有氧呼吸速率提高以及ATP产生总量增加(P<0.05)。3.敲低Blnc1后,3T3-L1前脂肪细胞出现线粒体受损的情况,表现为线粒体染色变浅,线粒体DNA拷贝数减少,电镜下线粒体内嵴减少和基质肿胀以及线粒体生物合成相关基因表达下调(P<0.05)。线粒体功能方面,敲低Blnc1的前脂肪细胞的线粒体电子传递链复合物的表达显著下调,有氧呼吸速率降低以及ATP产生总量减少(P<0.05)。结论在3T3-L1前脂肪细胞中,Blnc1对于线粒体的生物合成和功能是必需的。过表达Blnc1能够增加细胞的线粒体DNA拷贝数,上调线粒体生物合成和电子传递链复合物的表达水平,促进细胞的线粒体有氧呼吸和ATP产生。敲低Blnc1能够减少细胞的线粒体DNA拷贝数,下调线粒体生物合成和电子传递链复合物的表达水平,抑制细胞的线粒体有氧呼吸和ATP产生。第三部分Blnc1调控前脂肪细胞线粒体生物合成和功能的分子机制研究目的Lnc RNA调控靶基因的作用机制复杂多样,核内的lnc RNA发挥作用的分子机制之一就是通过招募一些转录因子或RNA结合蛋白来激活或者抑制靶基因的转录。因此我们推测Blnc1可能通过结合相关蛋白来调控前脂肪细胞的线粒体生物合成和功能。本研究目的是寻找与Blnc1直接结合的RNA结合蛋白及其调控靶基因的具体分子机制。方法采用RNA蛋白下拉和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验,筛选得到与Blnc1结合的RNA结合蛋白。再通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术,探讨Blnc1与相关RNA结合蛋白调控Pgc1β的具体分子机制。结果1.通过RNA蛋白下拉和RIP实验技术,确定了Blnc1和hn RNPA1是直接相互结合。2.在3T3-L1前脂肪细胞中,过表达hn RNPA1能够显著下调Pgc1β的表达水平(P<0.001)。根据Pgc1β上游启动子序列和hn RNPA1常见结合区域的比对,寻找到多个hn RNPA1与Pgc1β启动子区域结合的位置。采用Ch IP实验,验证了hn RNPA1抗体确实能够富集Pgc1β启动子区域(P<0.001)。3.在过表达Blnc1的3T3-L1前脂肪细胞中,进行上述Ch IP实验,观察到过表达Blnc1后,hn RNPA1与Pgc1β启动子区域的结合明显减少(P<0.05)。结论Blnc1与hn RNPA1蛋白可以直接结合。Hn RNPA1能够与Pgc1β启动子区域特异性结合并抑制Pgc1β的转录活性。Blnc1调控前脂肪细胞线粒体生物合成和功能的机制之一是通过干扰hn RNPA1对线粒体生物合成关键基因Pgc1β的转录抑制。