论文部分内容阅读
背景与目的布-加综合征（Budd-Chiari syndrome,B-CS）是一种罕见的充血性肝病,其特征为在没有心脏或心包病变的条件下,由于肝脏静脉流出通道的堵塞而引起肝脏流出减少、胃肠道大出血等。而导致布-加综合征的梗阻,往往是小或较大的肝脏静脉以及下腔静脉的肝上部分静脉。越来越多的证据表明,在西方人群与亚洲人群之间布-加综合征特征有着明显的的区别。在西方发达国家,布-加综合征最普遍的病理生理机制为血液粘稠度增加。相反地,长期以来血管损伤一直被认为是亚洲国家布-加综合征的主要原因。最新的研究表明,布-加综合征应该被认为是一种与肠道菌群微生态失调相关的肝脏疾病。根据以往的报道,肠道微生物群落在代谢、肠道屏障功能、肠道通透性和免疫系统成熟中起重要作用。肠道致病菌及其毒素向肠腔外组织器官的移位受到了肠道屏障的阻隔,从而使得宿主免受内源性微生物及其相关产物的侵扰。肠道寄居的有益菌可通过调节肠道酸性环境、产生抗菌肽、竞争黏附部位和营养等途径阻止病原菌的定植,被认为是抵御致病菌感染的天然屏障。研究表明,尽管这些微生物寄居在肠道中,但微生态失调的负面效应可能引起全身效应。肝脏和肠道之间存在着相互作用,这种相互作用的破坏可能会引起很多种肝脏疾病,例如肝硬化、肝脏炎症、肝细胞癌等。通常认为,肠道细菌及其衍生物和代谢终产物能通过门静脉途径转移至肝脏内,在肠道微生态失调过程中引起肝脏相关疾病恶化。既往课题组内研究表明,紊乱的肠道菌群可能是布-加综合征疾病发生的基础。本研究重点探讨肠道菌群通过粪便菌群移植（faecal microbiota transplantation,FMT）在布-加综合征疾病发生发展中的作用。研究目的通过构建布-加综合征粪菌移植小鼠模型,探讨肠道菌群在布-加综合征发生发展中的作用。方法选取20只一般情况一致的6周龄健康C57BL/6J雄性小鼠,在相同的光照时间（12h光照/黑暗周期）和洁净环境下饲养42天。随后随机分为两组,每组10只:布-加综合征患者粪便菌群移植组（B-CS组）和健康对照组（Control组）。B-CS组小鼠每日经口接种200μL患者粪便混悬液,连续42天,而对照组小鼠补充相同体积的健康成人粪便混悬液。42天后处死小鼠后,对20例小鼠的血液样本、粪便样本和组织样本进行及时有效收集保存。通过16S r DNA扩增子测序技术对小鼠粪便样本进行相关分析。对小鼠的肝脏和肝后端下腔静脉组织样本进行苏木精-伊红（HE）检测和血管相关蛋白（ICAM-1、v WF、CD31和CD34）免疫荧光检测。对小鼠结肠组织进行HE检测以及ZO-1和Occludin的免疫组化检测和免疫荧光检测。随后,分别对布-加综合征患者和小鼠的外周血清样本进行多细胞因子分析:IL-8,IP-10,Eotaxin,TARC,MCP-1,RANTES,MIG,ENA-78,MIP-3α,GROα,I-TAC,MIP-1β,TSLP,IL-1α,IL-1β,GM-CSF,IFN-α2,IL-23,IL-12p40,IL-12p70,IL-15,IL-18 IL-11,IL-27,IL-33,IL-5,IL-13,IL-2,IL-6,IL-9,IL-10,IFN-γ,TNF-α,IL-17A,IL-17F,IL-4,IL-22和IL-21。结果1.16S r DNA测序分析表明,布-加综合征患者粪便菌群移植组和对照组间肠道菌群物种多样性存在显著差异（P＜0.05）。B-CS组和对照组中的差异分类群中,15个属（Lactobacillus、Bacteroides、Christensenella、Bilophila、Butyricimonas、Prevotella、Akkermansia、Rc4-4、Tepidibacter、Coprococcus、Anaerostipes、Bacillus、Escherichia、Anaerofustis和Ruminococcus）的相对丰度急剧增加（P＜0.05）。同时,显著的差异菌群主要参与了膜转运、碳水化合物代谢、转录、外源性物质生物降解代谢、脂质代谢、免疫疾病、代谢、遗传信息处理等功能通路。这些结果与本课题组之前在布-加综合征人群队列中观察的结果相似。2.组织病理学结果显示B-CS组小鼠的肝组织在中央静脉、门脉区周围和肝实质中显示大量肝细胞气球样变,并伴有细胞肿胀和松散、浅染色的空泡化细胞质。此外,在B-CS组小鼠肝后静脉血管的中层发现中度或重度水肿和细胞肿胀,但在对照组中未发现。免疫荧光结果表明B-CS组小鼠下腔静脉中ICAM-1、v WF、CD31、CD34的荧光强度高于对照组。此外,B-CS组小鼠肝脏中ICAM-1和v WF的荧光强度高于对照组。结肠组织进行组织学检查。HE染色显示B-CS组小鼠结肠粘膜层淋巴细胞浸润以及的轻度水肿和腺间距增宽。免疫组织化学和免疫荧光试验显示B-CS组小鼠结肠中的ZO-1和Occludin水平低于对照组小鼠。3.多细胞因子分析显示,与正常人群相比,在布-加综合征患者中分析的20种细胞因子（IFN-α2,IL-17F,IL-23,IL-27,IP-10,I-TAC,TSLP,MCP-1α,GM-CSF,IL-1α,IL-1β,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-9,IL-10,IL-12p40,IL-13和IL-17A）的浓度显著升高（P＜0.001）。类似地,B-CS组小鼠的IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-17A、IL-17F和IL-13水平高于健康对照（P＜0.05）。这些显著升高的细胞因子与在人体中发现的差异一致。结论通过粪菌移植模型,我们发现布-加综合征患者粪便菌群会导致小鼠模型肠道发生相似的紊乱,而且紊乱的肠道菌群参与了免疫相关功能。小鼠模型中发现的血管改变和肠屏障损伤以及多细胞因子检测显示的免疫失衡,这些都表明肠道菌群失调可能通过免疫途径促进布-加综合征疾病的发生发展。