神经类疾病日趋高发,对广大人民群众的身体健康和生活质量产生越来越大的影响,但目前对于退行性和损伤性神经系统疾病,传统的方法无法治疗,干细胞的移植治疗为其提供了可能。但由于缺乏合适的方法获得足够的病人特异性的功能性神经元或者神经干细胞,限制了通过自体移植细胞治疗的研究和应用。iPSCs重编程技术的出现虽然可以为我们提供病人个性化的神经细胞,但是其转化效率低,且存在着潜在导入致癌基因、引发致瘤等安全风险,所以并不是理想的神经类细胞的获取方法。与其相比,细胞转分化技术不需要细胞去分化到多能性状态,而是将分化的细胞直接转化为另一种细胞状态,因其转化效率更高、用时更短、安全风险相对更低,逐渐成为研究的重点。神经干细胞在脑部发育过程中主要经过两个不同的发育阶段,即神经上皮干细胞(neuroepithelial stem cells,NESCs)和放射胶质前体细胞(radial glial progenitor cells,RGPCs)。NESCs是神经管阶段的神经干细胞,具有很强的增殖和分化能力,能产生整个脑部的神经细胞和高纯度(>80%)的神经元。NESCs在体内只是短暂的存在,它的异常增殖和分化将导致神经管和脑部的发育缺陷。因此,NESCs具有重要的科学和应用价值。以往建立的转化体系,仅能获得RGPCs,而RGPCs具有高度的不稳定、高度异质、低效率的神经元分化能力,无法满足基础研究和临床的需要。因此,将成纤维细胞直接转化为可长期扩增的NESCs,不仅有利于探索大脑的发育、神经网络环路和信号传导等相关科学问题,而且也是一种用于治疗神经类疾病的理想细胞来源。在本实验中,我们首先采用非人灵长类作为研究模型,利用载有Sox2、Oct4和Klf4三个转录因子的逆转录病毒感染胎猴成纤维细胞,优化转分化中细胞的培养条件,获得了纯化的神经上皮干细胞,并且通过长时间的传代以及分化等实验对所获得神经上皮干细胞进行了鉴定。转分化的神经上皮干细胞不仅表达神经干细胞特有的特异性分子标记Nestin、PAX6,而且还表达神经上皮干细胞极性相关的N-cadherin,证实我们所获得的细胞为神经上皮干细胞。这些神经上皮细胞能够在长期过程中保持稳定的增殖,能够实现单细胞扩增,具有分化为三种谱系神经细胞的能力,其分化能力在长期培养中保持了稳定性。另外一方面,神经损伤诸如脊髓损伤后,体内胶质细胞大量增生,形成胶质疤痕。胶质瘢痕是中枢神经元轴突再生的主要障碍之一。去除胶质疤痕是实现脊髓损伤后神经元再生的关键。遗憾的是目前仍缺乏很好的方法,已成为神经再生的国际性难题。从再生医学角度出发,假如我们能够将大量增值的星型胶质细胞直接转化为神经元:1)可以去除过度增值的星型胶质细胞带来的神经胶质阻碍,削弱胶质疤痕的屏障,改善大脑的微环境,促进神经的再生,更有效的重建神经系统功能;2)转化的神经元可以替代丢失的神经细胞而发挥功能。以前传统的转分化方法是采用病毒方法,存在安全隐患。而小分子诱导的方法无疑是解决该问题的关键。本研究中,我们初步探索利用化学小分子直接将星型胶质细胞转化为神经元。经过大量的分子筛选,我们的实验发现CHIR99021、LDN193189、Purmorphamine、Repsox四个小分子化合物组合能成功将星型胶质细胞直接转化为神经元。进一步的研究发现,这四个小分子化合物都是维持转化所必须的。总之,通过本论文的研究,我们首先构建了一种新的可从成纤维细胞中快速获取单一纯化灵长类动物神经上皮干细胞的程序,所获得的神经上皮干细胞体外具有无限的增殖能力,易于体外大量扩增,且能在不同的条件下分化为多种神经元和胶质细胞,这将为神经类疾病发病机制和细胞替代治疗等研究提供很好的细胞来源。同时通过小分子诱导星型胶质细胞转分化为神经元的研究,将为神经损伤等疾病的神经修复提供一种新的策略。