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动脉导管（ductus arteriosus, DA）是存在于主肺动脉之间一条特殊的血管性通道，在胚胎期DA将血液从肺动脉分流大部分至降主动脉，从而维持胎儿的生长发育，出生后DA迅速出现由收缩引起的功能性关闭，并逐渐发生解剖性闭合。婴儿出生3个月后DA仍然持续开放者，则为动脉导管未闭（patent ductus arteriousus, PDA）。PDA是最常见的先天性心脏病（congenital heart disease, CHD）之一，其在足月儿中的发病率可高达0.05%，如果PDA未得到及时处理，常可造成充血性心衰（heartfailure）、肺动脉高压（pulmonary artery hypertension）、心内膜炎（Endocarditis）等疾病的发生，危害人类的健康，因此PDA的发病机理一直是小儿心血管领域的研究重点。DA是在胚胎发育的第5week起，由第6对咽弓的左侧背部逐渐演变而成，在组织学上DA主要是由心脏神经嵴细胞（neural crest cells, NCCs）分化演变而成，因此心脏神经嵴细胞的分裂增殖、维持、分化迁移过程中出现的任何异常将会对DA的正常闭合产生重要影响。TFAP2B（transcription factor AP-2beta）则是NCCs来源的转录因子（Transcription factor），因此该基因在动脉导管的发育形成及闭合过程中必然发挥了重要的作用。研究表明孤立性PDA患者亲属的再发率上升至5%，说明遗传因素的确参与了PDA的形成。Char综合征（Char syndrome）则是一种以PDA、面部、手指畸形为特征的综合症疾病。Satoda等首先在家族性的Char综合症病人的TFAP2B基因（gene）中发现了两种错义点突变（mutation），这些突变使TFAP2B降低了转录激活活性，并且突变产物展现了显性抑制的效应。其他学者随后也在Char综合症家系病例中发现TFAP2B第3和4内含子侧翼序列变化，导致了由于mRNA异常剪切而产生的基因单倍剂量不足（Haploinsufficiency）的效应。既往有关于TFAP2B突变与PDA致病机理的研究大都以Char综合征为研究对象。由于临床上孤立性PDA的发病率远高于综合症型，为了研究TFAP2B基因突变（gene mutation）在孤立性PDA发病中所起作用，以及PDA发病潜在的遗传机制，我们拟对孤立性PDA患者之TFAP2B基因进行测序检查，以期寻找与PDA发病相关的TFAP2B新的基因序列变化。根据所获得的TFAP2B突变序列，我们采用基于重叠PCR的方案，构建突变基因体外表达载体，对突变的基因在分子和细胞水平展开功能研究，分析TFAP2B突变导致PDA发病的作用机制。第一部分PDA患者TFAP2B基因的突变检测研究目的本研究拟通过对孤立性PDA患者的TFAP2B基因进行测序筛查，寻找可能存在的新的基因序列变化，分析TFAP2B基因突变与PDA发病的相关性。对象和方法研究对象为孤立性PDA患者、以及来自我院门诊参加健康体检，未合并任何先天性心脏病的正常儿童对照。知情同意后采集他们的外周血样本，根据TFAP2B基因序列信息设计合适的引物，用以扩增样本TFAP2B基因全部的7个exons以及部分的侧翼序列，所扩增的DNA片段进行测序，将获得的测序结果与Genbank上TFAP2B公布的序列信息进行比对。结果通过对孤立性PDA患者TFAP2B基因进行测序研究，我们发现两个PDA患者家系中分别存在c.435438delCCGG和c.601+5G>A两种新型基因突变，而未受累的家系成员以及正常人群对照则无此突变。结论TFAP2B基因c.435438delCCGG和c.601+5G>A mutation与孤立性PDA的发病相关。第二部分TFAP2B基因突变真核表达载体的构建及鉴定研究目的本研究拟通过基于重叠PCR反应的方法构建TFAP2B基因c.435438delCCGG和c.601+5G>A突变真核表达质粒载体。材料和方法对所发现的两种TFAP2B突变进行序列分析发现c.435438delCCGG在第2外显子3’端缺失CCGG碱基序列，而c.601+5G>A突变造成TFAP2B基因转录的mRNA产物缺失整个第3外显子。我们已具有TFAP2B野生型表达载体pcDNA3-TFAP2B，基于该载体序列以及突变序列分别设计含有突变序列的引物及与模板配对的引物，通过两轮PCR反应扩增含有突变序列的DNA片段，将此片段通过与模板配对的引物所含的酶切位点连接进入pcDNA3载体。结果构建了TFAP2B c.435438delCCGG以及c.601+5G>A突变真核表达载体，命名为：pcDNA3-c.435438delCCGG及pcDNA3-c.601+5G>A。结论基于重叠PCR反应的方法适用于构建含较长缺失片段突变的表达载体，所构建的TFAP2B突变表达载体经酶切及测序鉴定符合要求，可以用来进行下一步的突变基因的功能研究。第三部分TFAP2B基因突变的体外功能分析研究研究目的对发现的c.435438delCCGG以及c.601+5G>A突变进行功能研究，并分析该突变导致PDA发病可能的机制。材料和方法将突变型表达载体与携带3拷贝AP2启动子驱动luciferase表达的质粒（p3×AP2-luciferase）共转染U2-OS细胞，检测突变型TFAP2B的转录激活活性；体外转染U2-OS细胞，通过Western blot检测突变型TFAP2B的体外表达、细胞免疫荧光检测突变型蛋白的表达及亚细胞定位。将突变型与野生型TFAP2B表达载体共转染U2-OS细胞检测突变基因是否引起显性抑制效应。构建c.435438delCCGG突变型TFAP2B、TFAP2A与分裂的Renilla荧光素酶N端Rluc1和C端Rluc2融合表达的载体，根据是否出现Renilla荧光素酶活性的重组而判断c.435438delCCGG突变型TFAP2B能否与TFAP2A结合。将c.435438delCCGG TFAP2B突变表达载体和野生型TFAP2B表达载体转染U2-OS细胞，通过对细胞自噬体和溶酶体数目的检测来间接反映野生型和突变型TFAP2B对细胞生长的影响。结果两种突变基因的转录激活作用失活，并且Cited2不能进一步促进突变型TFAP2B激活Luciferase报告基因表达；野生型TFAP2B激活Luciferase报告基因的能力可被升高的Cited2的浓度进一步提升，两种突变的TFAP2B对升高的Cited2的剂量基本无应答。Western blot检测发现野生型及c.435438delCCGG突变型TFAP2B表达了相应的特异性蛋白，但c.601+5G>A突变基因无表达产物。细胞免疫荧光检测亦未发现明显的c.601+5G>A突变表达出相应的蛋白，野生型及c.435438delCCGG突变型TFAP2B表达出相应的特异性蛋白，并且两种蛋白的分布均以核内为主。c.435438delCCGG突变型对野生型TFAP2B基因的转录激活功能产生了部分抑制作用。随后成功构建了c.435438delCCGG突变型TFAP2B、TFAP2A与分裂的Renilla荧光素酶Rluc1和Rluc2融合表达的载体pcDNA3-delCCGG-Rluc1和pcDNA3-TFAP2A-Rluc2，通过对分裂的Renilla荧光素酶活性的重组检测发现c.435438delCCGG突变的TFAP2B能与TFAP2A结合。将突变和野生型TFAP2B表达载体转染U2-OS细胞后，野生型TFAP2B显著的提高了体外培养细胞的自噬体和溶酶体数目，而c.435438delCCGG突变型TFAP2B转染的细胞产生的自噬体及溶酶体数目较少。结论c.435438delCCGG和c.601+5G>A突变型TFAP2B均失去了转录激活作用，并且可能具有不同的功能：显性抑制（dominant negative）和单倍剂量不足（haploinsufficiency）效应。这两种类型的突变在不同程度上负向调控了TFAP2B基因的功能，继而影响了与动脉导管平滑肌细胞生长分化有关的靶基因的表达，从而导致了PDA的发生。