【摘 要】
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目的:研究miRNA-200c（miR-200c）富集的外泌体递送是否参与溶酶体组织蛋白酶L（cathepsinL,CTSL）介导的A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药,并探索其潜在的分子机制。方法:（1）使用A549、A549紫杉醇耐药（A549/TAX）和A549顺铂耐药（A549/DDP）细胞。试剂盒法提取细胞外泌体,通过Zeta电位分析仪,透射电镜,western blot和荧光共聚焦显微镜示踪
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目的:研究miRNA-200c（miR-200c）富集的外泌体递送是否参与溶酶体组织蛋白酶L（cathepsinL,CTSL）介导的A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药,并探索其潜在的分子机制。方法:（1）使用A549、A549紫杉醇耐药（A549/TAX）和A549顺铂耐药（A549/DDP）细胞。试剂盒法提取细胞外泌体,通过Zeta电位分析仪,透射电镜,western blot和荧光共聚焦显微镜示踪法进行外泌体的鉴定和摄取分析;（2）A549细胞转染miR-200c inhibitor,在此基础上分别转染Smad2/CREB5过表达质粒或小干扰RNA;A549/TAX 或 A549/DDP 细胞转染 miR-200c mimics,并分别联合转染 Smad2/CREB5过表达质粒或小干扰RNA。q-PCR检测各细胞及提取的外泌体中miR-200c的表达变化,western blot检测 CTSL、磷酸化Smad2或CREB5以及EMT相关蛋白,CCK8、细胞流式和彗星实验检测细胞对紫杉醇或顺铂的敏感性,transwell和划痕实验评估细胞的侵袭迁移能力;（3）皮下裸鼠移植瘤实验瘤内注射富集miR-200c的外泌体进一步评估miR-200c外泌体递送在CTSL介导的A549细胞紫杉醇和顺铂耐药中的作用。结果:（1）与A549细胞相比,A549/TAX和A549/DDP细胞中miR-200c低表达,CTSL 高表达,A549 细胞转染 miR-200c inhibitor 后,CTSL、磷酸化 Smad2 和 CREB5表达量均上升,A549/TAX和A549/DDP细胞转染miR-200c mimics后,CTSL和磷酸化Smad2或CREB5均减少;（2）通过联合干扰A549细胞中Smad2或CREB5,能有效抑制单纯miR-200c inhibitor组中CTSL表达的上调,增加细胞凋亡,降低侵袭迁移;（3）而在转染miR-200cmimics的A549/TAX或A549/DDP细胞中进一步过表达Smad2或CREB5,CTSL的表达量反而升高,耐药性增加,EMT现象加剧;（4）富集miR-200c的外泌体体内外有效递送可升高受体A549/TAX和A549/DDP细胞miR-200c水平,可能通过降低磷酸化Smad2和CREB5来下调CTSL表达,从而逆转A549细胞紫杉醇和顺铂耐药。结论:相比A549细胞,A549/TAX和A549/DDP表达低水平miR-200c及高水平磷酸化Smad2或CREB5和CTSL蛋白。而且miR-200c可以通过外泌体的递送作用升高受体细胞miR-200c水平,可能通过降低磷酸化Smad2和CREB5来下调CTSL,从而逆转A549细胞紫杉醇和顺铂耐药。
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