脊髓损伤是中枢神经系统的严重创伤,一旦发生,往往造成患者终身残疾,给家庭和社会带来沉重的负担。继发性炎症反应在脊髓损伤的病程中起着重要的作用,其引发的一系列病理反应严重阻碍损伤修复的进程。在参与继发性炎症反应的众多细胞中,骨髓源性巨噬细胞扮演着关键角色,其占据损伤中央区,持续炎性分泌,最终导致了组织不可逆转的坏死、凋亡。巨噬细胞具有极化的特性,在不同的刺激下,可极化为具有细胞毒性的M1型细胞或具有抑炎促修复作用的M2型细胞,发挥不同的生物学作用。在脊髓损伤的病程中,具有细胞毒性的M1型巨噬细胞占据主导,而M2型细胞仅一过性增高,这种特殊的极化状态,进一步导致了脊髓的不可逆损伤。前期大量研究证明,通过改变脊髓损伤过程中巨噬细胞极化的状态,抑制M1型细胞的主导地位,可有效地促进脊髓损伤的修复。弱激光治疗是指利用低辐照度激光的生物学效用,进行局部照射,产生抑炎促修复作用的一种无创性治疗手段,目前在临床多个领域已广泛应用。前期大量研究证明,利用810nm的弱激光进行照射,可显著提高脊髓损伤动物运动功能的恢复,促进神经元存活,抑制损伤区炎症因子TNF-α、IL-6等的分泌,同时,相关研究也发现,810nm弱激光照射可显著下调损伤区M1型巨噬细胞数量,上调M2型巨噬细胞比例。但弱激光能否直接作用于脊髓损伤病程中的关键细胞—骨髓源性巨噬细胞,调控其极化表型,改变其分泌状况,这些问题尚不明确。为了回答以上问题,开展如下两部分实验研究。实验一:弱激光照射对M1型骨髓源性巨噬细胞活力及极化状态的影响目的:研究弱激光治疗对M1型骨髓源性巨噬细胞活性及极化的作用方法:使用Balb/c小鼠提取原代骨髓源性巨噬细胞,培养基中加入100ng/ml LPS和20ng/mL IFN-γ对其进行极化刺激,采用流式细胞术观察极化情况,获得成熟的M1型细胞。将M1型细胞随机分为照射组与对照组:照射组采用固定功率密度参数(2mW/cm~2)及照射面积(4.5cm~2),通过调整不同的照射时长,获得0.4J(44s)、4J(440s)及10J(1111s)三个能量组;对照组置于暗箱,不进行照射。照射后2、24小时,使用CCK 8法检测细胞活性。在照射后6小时,使用RT-qPCR法检测M1型细胞表面标志物iNOS的mRNA表达,照射后24小时,使用免疫印迹法及免疫荧光形态学染色对iNOS蛋白层面的表达进行检测。结果:弱激光照射后2小时,各组间细胞活性未出现显著变化,照射后24小时,4J组细胞活性显著增强,高于对照组及其他照射组。弱激光照射后6小时,激光照射组iNOS的mRNA表达较对照组显著下降;照射后24小时,0.4J组及4J组iNOS蛋白表达较对照组显著下降,而10J组则未发现显著差异。结论:本实验所采用的弱激光可以提高M1型骨髓源性巨噬细胞的活性,抑制其极化的表达,且这种作用具有一定的时间、剂量依赖性。实验二:弱激光照射对M1型骨髓源性巨噬细胞分泌的影响及机制研究目的:研究弱激光对M1型骨髓源性巨噬细胞分泌的影响及相应机制方法:将培养成熟的M1型细胞随机分为弱激光照射组及对照组,激光参数同实验一。照射后6小时使用RT-qPCR法对促炎因子TNF-α、IL-1β及MCP-1的mRNA进行检测。照射后24小时使用酶联免疫吸附试验对TNF-α、IL-1β、MCP-1以及神经营养因子BDNF和NGF的分泌进行检测。照射后2小时及24小时使用ROS探针对M1型细胞的ROS含量进行检测。使用免疫荧光形态学染色,对采用弱激光-M1型巨噬细胞上清液过继培养的背根神经节细胞轴突进行染色。使用免疫印迹法,检测经典极化通路NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表达。结果:弱激光照射后6小时,相较对照组,0.4J及4J组TNF-α及IL-1β的mRNA表达显著下降;而对比对照组,弱激光未显著改变MCP-1的mRNA表达。照射后24小时检测发现,相比对照组,0.4J组的照射可以显著抑制IL-1β的分泌,上调MCP-1的分泌;4J组中,TNF-α、IL-1β的分泌显著下调,MCP-1、BDNF及NGF分泌显著上升,经典极化转录因子NF-κB p65、Phospho NF-κB p65的表达受到明显抑制;10J组的照射,可以显著抑制TNF-α的分泌。ROS探针的检测发现,照射后2小时,10J组ROS含量较其他组显著上升,而24小时后,4J组ROS含量显著低于对照组及10J组。过继培养背根神经节细胞24小时后,相较对照组,4J组及10J组上清液可显著促进背根神经节细胞轴突的生长。结论:,本实验应用的弱激光可以直接作用于M1型骨髓源性巨噬细胞,抑制其炎性分泌,下调氧化应激反应,上调神经营养因子的分泌,促进神经轴突的生长,且弱激光调控巨噬细胞极化和分泌的作用,可能与其下调经典极化通路NF-κB p65/Phospho NF-κB p65表达有关。