论文部分内容阅读
全球的污染物排放增加,带来了巨大的健康和环境问题。重金属如镉(Cd)、铅(Pb)、铜(Cu)、铬(Cr),具有高毒性,是重要的环境污染物,通过工业废水、城市和矿业资源等排放到环境中,到达水生环境,在水生生物体内积累,经由食物链对人类造成危害。斑马鱼是一种对环境污染物较为敏感的模式生物,已被广泛应用于胚胎发育毒理学、环境毒理学、病理毒理学、药物毒理学等多个领域,并展现出其特有的优势。本研究旨在全面评价重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼的毒性效应,了解重金属毒性作用的特点、性质、程度及毒性作用机制,明确重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化防御系统,细胞凋亡及免疫系统的毒性作用及其机制,为阐明重金属毒性作用和重金属污染的环境风险评估提供依据。主要研究内容包括：重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化能力指数的影响、重金属镉(Cd)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究、重金属铅(Pb)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究、重金属铜(Cu)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究、重金属铬(Cr)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究。主要研究结果如下：1)本研究以抗氧化能力指数(Oxygen radical absorbance capacity, ORAC)检测方法为基础,建立一种机体清除自由基能力的检测方法,并应用于生物抗氧化能力的的评价。研究选用国际标准试验用鱼-斑马鱼作为试验生物,针对过氧自由基(ROO·)进行检测,以偶氮化合物AAPH作为氧自由基来源,荧光素钠(FL)为荧光指示剂,并以维生素E类似物Trolox为定量标准,观察自由基与荧光素钠作用后荧光强度的衰退过程,检测各种物质加入反应体系后延缓荧光素钠荧光强度衰退的能力,以此评价反应体系中抗氧化剂的抗氧化能力。本研究所建立的定量分析方法具有特异性强；精密度高,变异系数小于5%；准确度在97%-108%之间；重现性佳(变异系数是2.92%)；定量检出限和最低检测限分别为3.03和1.00μmol Trolox/mg protein,可接受相关系数(R2)≥0.99。依据所建立的定量分析方法对斑马鱼ORAC生理正常值进行检测,正常值范围为0-50μmol Trolox/mg protein,并根据重金属对斑马鱼ORAC的影响,对重金属的污染程度和毒性效应进行了评级和分类,提高了试验数据互认程度,推动了抗氧化防御系统生物标志物在环境污染监测中的应用。2)重金属镉(Cd)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究结果表明：重金属Cd对斑马鱼成鱼和胚胎的96h-LCso分别为24.341mg/L和46.67mg/L,胚胎孵化抑制作用的96h-EC50为42.499mg/L。重金属Cd引起斑马鱼成鱼SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD, Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2mRNA表达水平下调,而p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因-α,IL-1β,INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3和核转录因子AP-1亚家族c-jun mRNA表达水平均上升。重金属Cd引起斑马鱼胚胎心率减慢,体长减小；ROS水平显著升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,CAT,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2和p53mRNA表达水平均上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β,INF-y mRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun,c-fos以及NF-κB亚家族relA mRNA表达水平均升高。以上结果提示Cd对斑马鱼成鱼和胚胎均具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生,毒性作用机制与MAPKs信号转导通路相关。3)重金属铅(Pb)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性作用及机制研究结果表明：重金属Pb对斑马鱼成鱼和胚胎的96h-LC50分别为0819mg/L口22.574mg/L,胚胎孵化抑制作用的96h-ECso为19.594mg/Lo重金属Pb引起斑马鱼成鱼SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bcl-2mRNA表达水平下调,而p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a,IL-1β, INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高：MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b, ERK2,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun, c-fos以及NF-κB亚家族nfkb2mRNA表达水平均上升。重金属Pb引起斑马鱼胚胎心率减慢,体长减小；ROS水平显著升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,CAT,Nrf2,HO-1mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因bc1-2和p53mRNA表达水平均上调；免疫系统相关基因TNF-α,IL-1βINF-γ mRNA表达水平均显著性升高；MAPKs信号转导通路相关基因p38a,p38b,ERK2,ERK3,JNK1和核转录因子AP-1亚家族c-jun,c-fos以及NF-κB相关基因relA mRNA表达水平均上升。以上结果提示Pb对斑马鱼成鱼和胚胎均具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生,毒性作用机制与MAPKs信号转导通路相关。4)重金属铜(Cu)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究结果表明：重金属Cu对斑马鱼成鱼的96h-LC5o0为0.462mg/L;引起SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a, IL-1β, INF-γ(?)IL-8mRNA表达水平均显著性升高。以上结果提示Cu对斑马鱼成鱼具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生。5)重金属铬(Cr)对斑马鱼成鱼的毒性作用研究结果表明：重金属Cr对斑马鱼成鱼的96h-LC5o为113.808mg/L；引起SOD活性升高,MDA含量增加,ROS水平明显升高；抗氧化防御系统相关基因Mn-SOD,Cu/Zn-SOD,Nrf2,mRNA表达水平上调；细胞凋亡相关基因p53mRNA表达水平上调；免疫系统相关基因TNF-a, IL-1β, INF-γ和IL-8mRNA表达水平均显著性升高。以上结果提示Cr对斑马鱼成鱼具有明显的毒性作用,能够诱导氧化应激,细胞凋亡及免疫毒性的发生。本研究对传统的ORAC方法进行了一定程度上的改良,并将此法应用于环境污染监测和毒理学研究,研究了重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼抗氧化防御系统的影响,并全面评价了重金属(镉,铅,铜,铬)对斑马鱼成鱼和胚胎的毒性效应及作用机制,发现氧化应激,细胞凋亡和免疫毒性之间存在着紧密的联系。