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视网膜血管性病变是一类以视网膜新生血管生成为标志、以纤维增殖为特征的常见致盲眼病。该病最终因视网膜新生血管增殖、出血和牵引性视网膜脱离而导致不可逆性失明。此类疾病致盲率高，但其发病机理目前尚未十分清楚。目前的研究认为，视网膜新生血管的生成是由于各种原因导致机体内新生血管生成的刺激因子和抑制因子之间平衡失调造成的。血管内皮生长因子(VEGF)是其中的关键因子。Neuropilin-1(NRP1)是最近新发现的VEGF165的受体，同时它还是semaphorin3A(Sema3A)的受体，在神经轴突的生长导向、血管的生成发育和肿瘤转移中发挥着重要作用。对于VEGF、NRP1和Sema3A三者在血管增殖性视网膜病变中所起作用的研究，将有助于我们进一步揭示该病的发病机制，为治疗提供帮助。
第一部分NRP1和Semli3A在培养的人视网膜血管内皮细胞(HRCEC)上的研究
目的：观察NRP1和Sema3A和在缺氧和高糖条件下培养的人视网膜血管内皮细胞中的表达。
方法：原代培养人视网膜血管内皮细胞并进行鉴定，取第2-4代的细胞进行实验。分别在正常、缺氧和高糖条件下培养细胞。三种培养条件培养至24h时，行免疫细胞化学染色，检测NRP1、Sema3A和VEGF的蛋白表达。三种培养条件分别在0h，12h和24h时，行RT-PCR检测细胞NRP1、Sema3A和VEGF mRNA的表达。
结果：在缺氧条件和高糖条件下培养24h后，均可见NRP1和VEGF的蛋白表达强于正常对照组，而Sema3A的蛋白表达则弱于正常对照组。在缺氧条件和高糖条件下，均可见NRP1和VEGF的mRNA表达随着干预时间的延长不断增强，Sema3A的mRNA表达随着干预时间的延长不断减弱。
结论：培养的HRCEC存在NRP1和Sema3A的表达，缺氧和高糖是刺激NRP1表达和抑制Sema3A表达的因素之一。
第二部分NRP1和Sema3A在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠和糖尿病视网膜病变(DR)大鼠视网膜上的研究
目的：观察NRP1和Sema3A在OIR小鼠和DR大鼠视网膜中的表达。
方法：
1.80只出生后7天内的C57／BL6小鼠随机分为模型组(64)只和正常组(16只)。出生后第7天，将模型组放入氧气含量为75％的饲养箱中饲养，出生后第12天返回正常大气环境中饲养，正常组一直在正常大气中饲养。出生后第17天，模型组和正常组行荧光素心脏灌注视网膜铺片及视网膜冰冻切片GSA染色验证成模情况。取模型组和对照组冰冻切片行免疫组织化学染色，观察NRP1、Sema3A和VEGF蛋白在模型组和对照组中的表达。在出生后第7、8、10、12、13、14、15、17天，提取模型组视网膜总RNA，行RT-PCR检测NRP1、Sema3A和VEGFmRNA在OIR小鼠视网膜中的表达。
2.取24只体重为190-210g的雄性Wistar大鼠，禁食12h后，腹腔注射链脲佐菌素。注射72h后取大鼠尾静脉血检测血糖，血糖值大于16.7mmol／L，的大鼠可作为糖尿病大鼠。以体重相似的正常大鼠作为正常组，腹腔注射等量等浓度枸橼酸钠溶液。在大鼠成模后24周，取模型组和正常组各2只大鼠，行冰冻切片免疫组织化学染色法观察NRP1、Sema3A和VEGF蛋白在模型组和正常组中的表达。成模后第4周、12周、24周，分别取模型组和对照组大鼠各3只，提取视网膜总RNA，行RT-PCR检测NRP1、Sema3A和VEGF mRNA在模型组和正常组中的表达。
结果：
1.视网膜铺片和GSA染色发现生后第17天时，正常组视网膜血管网基本发育完成，模型组小鼠视网膜存在大量新生血管和无灌注区。免疫组织化学染色发现生后第17天，模型组小鼠视网膜中NRP1和VEGF蛋白表达强于正常组，而Sema3A蛋白表达弱于对照组。在OIR小鼠模型中，VEGF的mRNA表达在高氧环境一直处于较低水平，进入相对缺氧期后不久就开始上升，并于生后第12天到达高峰，随后缓慢下降；NRP1的mRNA表达在高氧环境中不断下降，进入相对缺氧期后开始上升，并于生后第13天到达高峰，随后缓慢下降；Sema3A的mRNA表达在高氧环境中不断上升，进入相对缺氧期后开始下降，并于生后第13天降至最低，随后缓慢上升。
2.成模后24周，模型组大鼠视网膜中VEGF和NRP1蛋白表达强于正常组，而Sema3A的蛋白表达弱于正常组。在DR中，VEGF的mRNA表达在成模后4周迅速上升，随后12周时少量下降，但仍高于正常，24周时再次上升。NRP1的mRNA表达与之相似，成模后4周即发现NRP1的表达上升，随后12周开始下降，24周时再次上升。Sema3A的mRNA则与它们完全相反，4周时下降，12周时上升，24周时再次下降。
结论：除了内皮细胞，视网膜上的其他细胞例如RPE细胞可能也存在NRP1和Sema3A的表达。NRP1的高表达与Sema3A的低表达与视网膜新生血管形成密切相关。