神经元属于永久性细胞,损伤后不能以分裂增殖的方式进行修复。传统神经缺损修复方法以神经外膜、束膜缝合为主,后又出现外周神经导管修复技术,且应用日趋广泛。于神经断端放置不同材质的套管,创造了加速断端吻合的微环境。微环境内各类神经营养因子富集,有利于断端吻合。将神经干细胞与神经导管相复合共同修复外周神经缺损,使神经导管不单具有支持、导向的物理作用,更有促进神经再生的化学、生物作用,从而可提升修复效果。神经导管复合神经干细胞修复外周神经缺损,神经干细胞可分化为具有分泌功能的各类神经细胞,分泌神经生长因子及各类神经营养因子,加速神经断端吻合,加之套管创造断端吻合的微环境,使断端周围各类神经营养因子保持在较高浓度水平,更有利于愈合。雪旺细胞存在于周围神经系统,作为神经干内主要的非神经元活性细胞,不仅可分泌多种神经营养因子,同时还产生细胞外基质和细胞黏附因子,对促进周围神经生长发育、再生和修复起重要作用。神经干细胞是一类具有自我更新及不对称分裂能力的细胞群,主要分布于中枢神经系统。其具有强大的增殖分裂能力及多向分化潜能,通过不对称分裂,在产生新的神经干细胞,以维持自身数量恒定状态的同时,还可根据周围神经、体液因子的调节及损伤因素的影响产生出具有特定功能的前体细胞,进而参加神经系统的发育及修复过程。神经干细胞主要具有如下特性：较强的增殖分裂与自我更新能力、多向分化潜能、弱免疫原性及较强的迁徙能力。作为神经系统发育早期阶段的幼稚细胞,神经干细胞突起尚未形成,细胞表面的特定免疫原性蛋白分子尚未完全表达,细胞免疫原性较弱,为神经干细胞在已经发育完善的成体中枢及外周神经系统损伤的修复中奠定了重要的基础,后期免疫排斥反应较弱,有利于移植细胞的存活。同时,神经干细胞具有强大的增殖分裂能力、多向分化潜能及较强的迁徙能力,可接受病变部位神经源性信号的影响,参与神经结构和功能的修复。有文献报道在外周神经缺损的修复中添加神经干细胞可以促进神经断端吻合及后期功能恢复,起到良好的修复效果。神经干细胞的发现为神经系统的重建和再生提供了一个新的思路,打破了神经系统损伤后不能再生,只能由星形胶质细胞增生、瘢痕组织代替缺失神经元的传统观念。与此同时,神经干细胞的研究还存在诸多问题：如定向诱导分化是神经干细胞应用于临床的一个关键问题。移植后到达损伤部位的神经干细胞不能分化为具有针对性补充、修复功能的特定细胞,会导致移植治疗后显效慢,修复效果不佳,影响疗效,甚至导致局部炎症反应、移植后脑内瘤样团块形成压迫周围组织、外周神经系统神经瘤生成,加重损伤程度。迄今尚难获得来源于同一谱系,分化程度一致,细胞无异质性的神经干细胞,对神经干细胞移植治疗标准、疗效评价的制定造成影响。外周神经缺损多因外伤导致,导致损伤平面以下的支配区出现感觉、功能障碍。自体神经移植是外周神经缺损修复的金标准,其术式经典,且具有一定的疗效,但此方法对供区神经造成毁损,影响供区感觉、运动功能。异种生物型神经导管具有良好的通透性、机械强度及降解性,通过去抗原技术,去除了免疫原性且适宜细胞种植贴附,具有良好的应用前景。目前神经干细胞分离培养多取材于鼠,而相关大动物的神经干细胞培养报道则相对较少。另外,目前已知添加神经干细胞可促进外周神经缺损修复,提高修复效果,但添加神经干细胞后其转化、转归过程尚不明确。本实验主要对异种生物型神经导管修复山羊腓总神经缺损的效果及神经干细胞修复外周神经缺损的疗效及临床安全性予以论证,以初生山羊脑组织为材料分离培养山羊神经干细胞,模拟体内环境对神经干细胞进行诱导分化,并应用免疫组化方法检测分化产物,明确神经干细胞转化转归过程。本实验分为四部分,第一部分主要论述山羊神经干细胞培养液、诱导分化培养液及山羊雪旺细胞培养液的制备及细胞培养取材、分离培养方法,探讨神经干细胞培养及诱导分化的基本条件；第二部分主要为山羊神经干细胞、山羊雪旺细胞免疫组化检测方法与步骤；第三部分主要论述山羊神经干细胞体外诱导分化的步骤及相关分化产物的免疫组化检测、后期相关图像处理及统计学分析；第四部分论述以异种生物型导管联合同种异体神经干细胞修复山羊腓总神经缺损的效果,同时对神经干细胞移植后转化转归过程进行讨论。第一部分山羊神经干细胞培养液、诱导分化培养液、山羊雪旺细胞培养液的制备及山羊神经干细胞、雪旺细胞分离培养目的：探讨山羊神经干细胞、山羊雪旺细胞培养条件、山羊神经干细胞体外诱导分化条件；以手术方法获得1日龄山羊脑组织进行神经干细胞分离培养、获得坐骨神经进行雪旺细胞分离培养。方法：1.山羊神经干细胞培养液配制取DMEM-F12培养基47m1、N2添加剂0.5ml、B27添加剂lml配制成100ml培养液,加入成纤维细胞生长因子[bFGF]、表皮生长因子[EGF]各0.8μg配制成山羊神经干细胞培养液。2.山羊神经干细胞诱导分化培养液配制取DMEM-F12培养基37ml、胎牛血清10ml、N2添加剂0.5ml、B27添加剂lml配制成诱导分化培养液。3.山羊雪旺细胞培养液配制取DMEM培养基40ml、胎牛血清l0ml配置成山羊雪旺细胞培养液。4.山羊神经干细胞分离培养山羊麻醉后开颅,手术取出靠近皮质及海马部位脑组织,消化分散并培养5日后离心换液,继续培养并传代。5.山羊雪旺细胞分离培养手术取出山羊坐骨神经,剥离神经外膜并剪碎消化后以组织块法种植培养雪旺细胞,添加山羊雪旺细胞培养液并于2日后换液,继续培养2日后传代,每次传代利用差速贴壁法去除成纤维细胞,纯化雪旺细胞。结果：1.成功配制山羊神经干细胞培养液,其中bFGF、EGF浓度均为16ng/ml,B27体积分数2%,N2体积分数1%。2.成功配制山羊神经干细胞诱导分化培养液,其中含胎牛血清20%、N2添加剂1%、B27添加剂2%,不含EGF及bFGF。3.成功配制山羊雪旺细胞培养液,其中含胎牛血清20%。4.成功由山羊脑皮质、海马组织分离培养神经球样细胞团,镜下观察呈强折光性。5.成功以山羊坐骨神经分离培养梭形细胞,形态与雪旺细胞相同。结论：以含bFGF、EGF浓度16ng/ml,B27体积分数2%,N2体积分数1%的DMEM-F12培养基及组织块法可成功分离培养类山羊神经干细胞,待后期行抗-Nestin免疫组化染色可行确定。第二部分山羊神经干细胞、雪旺细胞免疫组化鉴定目的：以抗-Nestin免疫组化染色鉴定前期培养神经球,确定其神经干细胞属性；以抗-S100免疫组化染色鉴定前期培养山羊雪旺细胞,为后期体外诱导分化产物行免疫组化鉴定设定抗-S100阳性对照组。方法：1.抗-Nestin免疫组化染色实验分为阳性组及阴性对照组。前期培养类山羊神经干细胞进行抗-Nestin免疫组化染色并以SABC法显色；阴性对照组以生理盐水替代抗-Nestin一抗,余操作步骤及过程与阳性组相同。各组染色完成后于光镜下观察并拍照记录。2.抗-S100免疫组化染色此步骤意在鉴定所培养类山羊雪旺细胞并设定阳性对照组,与后期山羊神经干细胞体外诱导分化产物抗-S100免疫组化结果进行比较。类山羊雪旺细胞进行抗-S100免疫荧光染色并于染色完成后于荧光显微镜下观察、拍照。结果：染色得抗-Nestin、抗-S100阳性细胞,阴性对照组镜下未见明显阳性光点。结论：由山羊脑组织分离培养所得神经球样细胞团表达Nestin特异性蛋白,形态及蛋白标志物符合山羊神经干细胞特性；由山羊坐骨神经分离培养所得梭形细胞表达S100蛋白,形态及蛋白标志物符合山羊雪旺细胞特性。第三部分山羊神经干细胞体外诱导分化实验及分化产物免疫组化鉴定目的：以山羊神经干细胞诱导分化培养液模拟干细胞体内分化环境,诱导山羊神经干细胞进行体外诱导分化；以免疫荧光方法检测山羊神经干细胞体外诱导分化产物,同时对图像结果进行灰度量化；对量化后的检测结果阳性、阴性组进行统计学分析；探讨神经干细胞移植后在体内的转化转归过程。方法：1.山羊神经干细胞体外诱导分化前期培养山羊神经干细胞离心后去上清,并以山羊神经干细胞诱导分化培养液重悬沉淀细胞继续培养。2.体外诱导分化产物免疫荧光染色山羊神经干细胞体外诱导分化产物分别行抗-MAP2、抗-GFAP、抗-S100免疫荧光染色。分组设置：分化产物抗-MAP2、抗-GFAP免疫荧光染色结果作为阳性组,阴性对照组以生理盐水代替一抗,余步骤与方法同阳性组；分化产物抗-S100免疫荧光染色结果设为阴性组并与前述山羊雪旺细胞抗-S100染色阳性对照组进行比较。3.染色结果图像灰度量化及统计学分析各染色组随机取3个高倍视野,抗-MAP2、抗-GFAP及前述抗-Nestin、抗-S100染色阳性组每个视野随机取2个阳性点,对应阴性组每个视野随机取间隔较远的2点,各点以ImageJl.47图像分析软件进行灰度计算。计算均数后各组数据进行两独立样本t检验,设定P<0.05为具有显著性差异。结果：1.成功对山羊神经干细胞进行体外诱导分化,分化产物行免疫荧光染色抗-MAP2、抗-GFAP呈阳性反应,分化产物行抗-S100染色未检见阳性产物。2.各组免疫组化图像结果量化后进行两独立样本t检验,抗-Nestin染色、抗-MAP2染色、抗-GFAP染色各阳性组与阴性对照组比较P<0.01,具有显著性差异；分化产物与山羊雪旺细胞抗-S100免疫荧光染色结果进行比较P<0.01,具有显著性差异。结论：山羊神经干细胞可由血清进行体外诱导分化为神经元、星形胶质细胞,分化产物行抗-S100免疫荧光染色未检见阳性产物。第四部分生物型导管联合神经干细胞修复山羊腓总神经缺损的实验研究目的：通过动物实验证明添加神经干细胞辅助治疗外周神经缺损的疗效及安全性；进一步探究神经干细胞移植治后转归过程；探索添加雪旺细胞与神经干细胞混悬液对外周神经缺损的修复效果。方法：1.制备生物型神经导管以猪的血管壁、小肠粘膜为原料,通过环氧交联固定技术、多方位去抗原技术去除材料表面抗原,用胶原蛋白分子进行适当交联提高坚韧性。2.模型建立及实验分组手术建模,制作山羊腓总神经4cm缺损模型。实验分组：干细胞组以神经导管吻合缺损断端并于导管内添加神经干细胞悬液；混合细胞组以神经导管吻合缺损断端并于导管内添加神经干细胞／雪旺细胞混合悬液；空白组以神经导管吻合缺损断端并以生理盐水充盈导管；自体对照组以自体神经束原位翻转180。后吻合缺损断端,各组样本量各5只山羊,于后腿单侧建模。术后观察8个月并行解剖。比较建模前及术后8个月神经传导速度。3.愈合情况评价术后8个月行术区局部解剖,观察神经束吻合生长情况并测量直径,取吻合神经束行病理检测及HE、甲苯胺蓝染色及抗-S100、抗-Nestin、抗-MAP2、抗-NF、抗-NGF、抗-GFAP免疫组化染色。各染色组进行荧光密度比较,同时比较术前及术后8个月神经束直径差。结果：1.成功制备异种生物型神经导管,经去抗原处理及辐照灭菌后待用；2.成功建立山羊腓总神经4cm缺损模型并以神经导管吻合,各组分别添加细胞悬液充盈导管。山羊术后创口愈合可,未见死亡病例。建模前及局部解剖前分别行神经电生理检测,比较可见术后神经诱发电位幅度减小。3.术后解剖见术区神经断端吻合可,未见明显卡压及神经瘤生成。行病理检测见新生神经束连续性、完整性可,可见新生神经束自断端发出向对侧生长。4.术后吻合神经束行免疫组化检测结果如下：各组抗-Nestin染色结果呈阴性；各组抗-S100、抗-NF、抗-GFAP、抗-NGF染色呈阳性,其中混合细胞组及干细胞组较其他2组阳性光点密度具有显著性差异；各组抗-MAP2染色均为阳性,光点密度无显著性差异。术前及术后8个月神经束直径差值比较可得神经干细胞组及混合细胞组差值无差别,上述两组差值小于空白组及自体吻合组。结论：生物型导管联合神经干细胞修复外周神经缺损安全、有效,较单纯以神经导管修复外周神经缺损效果更佳。