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本文应用Ni-NTA亲和层析纯化重组人骨唾液酸蛋白(recombinant human bone sialoprotein,rhBSP),并对rhBSP的稳定性作了初步研究;应用聚乳酸一羟基乙酸(PLGA)生物可降解材料,采用W<,1>/O/W<,2>复乳溶剂蒸发法制备rhBSP缓释微球,优化了微球制备工艺;通过检测小鼠前成骨细胞MC3T3-El的ALP水平变化,分析微球释放的rhBSP对成骨细胞活性影响。主要研究结果如下:
1.分离纯化的rhBSP在66kD附近呈现分散条带,westem blotting证明其具有抗原特异性。
2.rhBSP的稳定性受温度影响较大,其在4℃,25℃下放置1个月,就已经发生降解;而在.20℃及冻干成粉可稳定保存4个月。
3.通过单因素考察和正交实验设计,优选出最佳的微球制备工艺为:PLGA浓度为120mg/ml,内外相体积比为1:16,分散相PVA的浓度为4%,超声功率为300W。按此工艺参数制备微球,其平均粒径为50±0.5μm,平均跨距为0.58±0.10,平均载药量(0.725±0.075)%,平均包封率为(64.876±0.680)%。优化工艺的重现性良好。
4.rhBSP在MC3T3-E1细胞培养早期(4d内)可以促进MCYT3-E1细胞的增殖,此后,各浓度的rhBSP对MC3T3-E1的生长影响与对照组相比无明显差异。PLGA微球释放的rhBsP与rhBsP具有相同的促进增殖晚期Mc3T3-E1细胞ALP合成,表明微球制备过程中,rhBSP的生物学活性未受影响。