线虫是各类农作物、花木及药材的重要病原生物之一，除了直接危害作物外，还可以传播植物病毒或与其他病原真菌、细菌一起造成复合感染。平均每年由线虫导致的全球作物经济损失超过1000亿美元。线虫主要为害植物的根系，造成根系发育不良、衰弱、甚至腐烂，致使作物生长缓慢、枯萎、变黄甚至死亡。利用化学农药控制植物线虫病害对环境污染严重，而且给人类健康带来很大威胁。生物防治作为一种环境友好型的防治方法，越来越受到人们的重视。为了获得最佳的线虫防治效果，人们需要更多更高效的杀线虫生防细菌，而自然选育和人工分离的传统方式耗时费力。为了提高生防细菌产生杀线虫化合物的能力，通过基因工程技术手段对生防细菌进行改造或对杀线虫化合物进行改良已成为获得新型高效生防细菌的重要途径。
　　娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)D74是从我国西部土壤中分离筛选的对多种农作物具有显著防病促生功能的植物促生细菌。从S.rocheiD74发酵液中分离到的大环内酯类化合物borrelidin表现出较好的抗线虫活性，使其成为研发植物生防工程菌的优秀材料。阿维菌素是链霉菌Streptomycesavermitilis的次级代谢产物，是一类十六元环大环内酯化合物，对为害棉花、蔬菜、松树等植物的多种线虫都具有很好的杀灭效果，而且对哺乳动物具有很高的安全性，无致畸、致癌、致突变作用，是一种很好的天然高效杀线虫化合物。S.avermitilis的全基因组序列已经公布，阿维菌素生物合成途径也已被详细阐明，其基因簇全长81kb，共有18个开放阅读框，其中包括4个聚酮合酶(PKSs)的编码基因和7个dTDP-L-夹竹桃糖的合成基因。
　　本论文为了实现阿维菌素在S.rocheiD74中的异源表达，人工构建了高效线虫病害防治土源链霉菌。首先建立了S.rocheiD74的高效接合转移系统，并利用ExoCET直接克隆技术成功将阿维菌素的基因簇(共82kb)从S.avermitilis基因组完整克隆到细菌人工染色体(BAC)载体上。然后通过接合转移和位点特异性重组，将阿维菌素的基因簇整合到了S.rocheiD74的基因组上，实现了阿维菌素在S.rocheiD74的异源表达，其中B1a组分的产量为20μg/L。为了提高阿维菌素的异源表达产量，我们将阿维链霉菌不同的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因克隆到S.rocheiD74中，结果使阿维菌素杀线虫活性最高组分B1a的产量提高了3倍，最高可达到77μg/L。为了重构阿维菌素基因簇，进一步提高其异源表达产量。
　　我们利用高效DNA组装技术，成功对阿维菌素基因簇进行了重构，使所有基因均受到链霉菌强启动子的控制。重构策略为:对21个阿维菌素生物合成基因按照功能进行分组:(1)aveA1-A4负责聚酮链的合成;(2)aveC，aveE，aveF和aveD负责糖苷配基的还原、环化和甲基化修饰，avtA、B负责阿维菌素的外排;(3)aveBⅠ-aveBⅧ负责糖苷配基的糖基化修饰;(4)aveG、aveR和orf-1负责调控。每组基因置于1-2个链霉菌来源的组成型强启动子控制之下构成操纵子，最终成功构建了86kb的人工基因簇。但重构的人工基因簇失去了合成阿维菌素的能力。初步分析原因可能是在重构基因簇中，聚酮合酶中最大的666kDaAveA2蛋白基因被链霉菌启动子转录，对克隆宿主大肠杆菌产生毒性，导致大肠杆菌对其突变，使其丧失功能。接下来我们将尝试利用在大肠杆菌内无活性的链霉菌强启动子来驱动聚酮合酶的表达，以期进一步提高阿维菌素在S.rocheiD74中的产量。
　　由于目前阿维菌素在S.rocheiD74的产量太低，我们未测试工程菌杀线虫活性。此外，我们还测试了多杀菌素高效基因簇在S.rocheiD74中的异源表达，结果S.rocheiD74重组菌株的多杀菌素产量比白色链霉菌(Streptomyces albus)J1074低10倍，这说明作为野生土源链霉菌S.rocheiD74表达聚酮类天然产物的能力较弱，很可能是其基因组上含有较多内源性聚酮基因簇导致的。接下来，我们计划敲除S.rocheiD74基因组上的聚酮基因簇，评估其作为聚酮类天然产物表达宿主的潜力，以期将S.rocheiD74开发为阿维菌素表达的优良宿主，将其用于线虫病害防治。