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目的 视网膜色素上皮(RPE)细胞具有复杂的结构和特殊的生理功能。它的吞噬功能对维持正常的视觉至关重要。该功能障碍时引起视细胞外节膜盘的堆积而导致严重的视网膜变性。国内外学者已经证实视网膜变性性疾病RPE细胞特异性吞噬功能障碍而非特异性吞噬功能正常,但其机理未得到阐明,进一步探讨吞噬功能及其机制,将对这类疾病的预防和治疗带来希望。目前虽已知RPE细胞的特异性吞噬功能涉及腺体-受体相互作用,启动跨膜信号传导系统;但是关于跨膜信号传导系统在RPE细胞的特异性吞噬过程中所起的作用仍不十分清楚。 为此我们选择信号传导通路中的一个信使分子钙离子作为研究对象。通过采取体外培养人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,HRPE),动态检测人视网膜色素上皮细胞特异性及非特异性吞噬过程中Ca2+浓度变化,明确Ca2+在HRPE的吞噬功能中所起的作用。 材料与方法 1.材料来源:取自中国医科大学附属一院眼科角膜术后的正常眼球,眼球供体年龄限制在24-36岁。 2.RPE细胞的培养及标记。采用胰蛋白酶消化法。 3.ROS的提取和人RPE细胞色素颗粒的制备。用细胞培养液调整浓度至107ml-1。 4.RPE细胞吞噬模型的制备。把1×107ml-1视杆细胞外节膜盘(rod outer segments,ROS)及色素颗粒分别加入到37℃孵育培养的正常HRPE细胞,在孵育的不同时间(5min-24h)终止吞噬反应。用双重荧光标记法检测HRPE细胞吞噬动力学。 5.细胞内钙离子浓度的检测:用荧光显微镜Fluo-3荧光负荷技术联合冷CCD计算机成像分析系统检测相应时间点的HRPE细胞特异性及非特异性吞噬时的Ca2+浓度。结果 1.特异性吞噬的启动明显早于非特异性吞噬。巧m初丑05结合于RPE细胞表面,1 .sh色素颗粒才结合于RPE细胞表面。 2.特异性吞噬组(ROS组):细胞内钙离子在巧面n出现了一个突然升高的峰,并在吞噬过程中一直维持高峰。经统计学检验与静息状态下的钙离子浓度有明显差异(P<0.05)。 3.非特异性吞噬组(色素颗粒组):在非特异性吞噬过程中细胞胞浆内钙离子未有明显变化,经统计学检验与静息状态下的钙离子浓度无明显差异(P>0 .05)。结论 1.HRPE细胞特异性吞噬过程中结合及吞人的启动早于非特异性吞噬。 2.CaZ+参与特异性吞噬过程,对吞人过程的维持十分重要,但不参与HRPE细胞非特异性吞噬的直接调节。说明特异性吞噬与非特异性吞噬在信号传导方面有着明显的不同。