【摘 要】
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精子是一类胞质高度浓缩的细胞,其所携带的胞质远远少于卵母细胞,所以传统的观念认为精子在受精过程中的主要贡献是提供合子一半的染色体,合子基因开放前胚胎的调控物质主要来源于卵母细胞,因此对早期胚胎发育调控的研究多集中于卵源物质,而忽略了在受精过程中,由精子携带进入的蛋白质、编码RNA及非编码RNA如mi RNA等精源性物质对早期胚胎发育的影响。我们的前期研究表明,牛精源性mi RNA在受精后胚胎的发育
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（编号:31472094）；
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精子是一类胞质高度浓缩的细胞,其所携带的胞质远远少于卵母细胞,所以传统的观念认为精子在受精过程中的主要贡献是提供合子一半的染色体,合子基因开放前胚胎的调控物质主要来源于卵母细胞,因此对早期胚胎发育调控的研究多集中于卵源物质,而忽略了在受精过程中,由精子携带进入的蛋白质、编码RNA及非编码RNA如mi RNA等精源性物质对早期胚胎发育的影响。我们的前期研究表明,牛精源性mi RNA在受精后胚胎的发育中起着至关重要的调控作用,并通过小RNAs测序发现了包括mi R-2285n、mi R-202和mi R-182等数个精子高表达的小RNAs,它们对牛早期胚胎发育作用有待于更进一步的研究。本试验系统研究了牛精子中mi RNAs表达最高的mi R-2285n对牛早期胚胎发育的影响及调控机制。研究的内容及结果如下:1.结合实验室建立的小RNA文库,通过对精子mi RNA进行定量试验,验证了bta-mi R-2285n在精子中是高表达的。2.借助在线数据库及生物信息学手段,预测了mi R-2285n在受精卵中的靶基因,结合MII期卵母细胞中的基因表达谱分析,初步筛选出CTTN及PFN1为mi R-2285n在受精卵中的靶基因。3.构建了CTTN和PFN1的3’-UTR表达及突变载体,使用Lip 3000将质粒和mi RNA mimic的共转染至293T细胞,以转染质粒和negative control mimic的共转染组作为对照组,发现CTTN及PFN1荧光强度均显著降低（P＜0.01）;接下来,使用实时荧光定量PCR在靶基因m RNA水平进行了验证:将质粒与negative control mimic/mi R-2285n mimic/mi R-2285n inhibitor分别共转染至牛成纤维细胞中,结果显示转染mi R-2285n mimic组的CTTN及PFN1在m RNA水平均极显著降低（P＜0.01）。最后,使用Western Blot在蛋白质水平进行验证:与转染了negative control mimic的对照组相比,mi R-2285n mimic转染组中PFN1蛋白表达水平显著降低,结果表明PFN1是mi RNA-2285n的靶基因。4.通过q PCR筛选出1μM为mi R-2285n mimic的最适注射浓度。对注射了1μM mi R-2285n mimic的孤雌2-cell及4-cell期胚胎进行免疫荧光染色,发现与NC注射组相比,PFN1蛋白的表达量显著降低（P＜0.05）,且更接近于IVF胚胎中的表达水平。注射1μM mi R-2285n mimic后,胚胎囊胚率显著升高（P＜0.05）,囊胚凋亡细胞数显著降低（P＜0.05）。最后,使用鬼笔环肽对F-actin进行染色。在孤雌2-cell及4-cell期胚胎中,注射mi R-2285n mimic组的F-actin荧光强度均强于注射NC组（P＜0.05）,推测PFN1可能会通过影响肌动蛋白骨架而对细胞分裂产生影响。综上所述,我们的研究表明牛精源性bta-mi R-2285n通过靶向PFN1调控早期胚胎肌动蛋白骨架,影响受精后胚胎第一次卵裂,进而调控牛早期胚胎发育进程。
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