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目的目前已证实,高危型人乳头瘤病毒(HR HPV)感染是宫颈癌发生的主要病因,但并非唯一病因。研究表明,叶酸缺乏有增加宫颈癌发生的风险。叶酸作为一碳单位的供体,参与DNA甲基化。研究发现DNA甲基化异常与肿瘤的发生关系密切。抑癌基因p16启动子区域CpG岛高甲基化是引起宫颈癌的一个重要原因。在DNA甲基化过程中起主要调控作用的是DNA甲基转移酶(DNMT),多种肿瘤细胞中均发现DNMT的异常高表达。以上事件在宫颈癌病变中存在一定联系,究竟有何相互作用,目前关于这方面的研究甚少。本次课题以HPV16阳性和HPV阴性宫颈癌细胞作为研究对象,在不同叶酸浓度干预下,观察细胞的增殖情况,检测两种细胞系中p16、DNMT1蛋白和mRNA表达情况,并分析以上事件在宫颈癌发生中的关系。方方法选择HPV16阳性宫颈癌细胞Caski和HPV阴性宫颈癌细胞C33A进行常规培养,取各个细胞系的对数期细胞进行不同叶酸浓度干预,采用MTT法观察叶酸对两种细胞活性的影响;通过细胞计数,绘制细胞生长曲线探讨叶酸对两种宫颈癌细胞增殖的影响;采用实时荧光定量PCR(real timePCR)检测HPV16癌基因E2、E6、p16以及DNMT1mRNA的表达;用Western blotting检测两种细胞中p16和DNMT1蛋白表达。使用SPSS16.0软件分析数据,正态分布资料用t检验、方差分析、Pearson相关和线性回归,等级资料用Spearman相关。结果1、叶酸对两种宫颈癌细胞的活性均有抑制作用,不同叶酸浓度下,除C33A细胞系中50ug/ml和100ug/ml外,其他实验组与对照组相比差别均有统计学意义(P<0.05),且在同一叶酸浓度下,叶酸对Caski和C33A两种细胞活性的抑制作用间的差别有统计学意义(P<0.05),且对Caski细胞的抑制作用强于对C33A细胞的抑制。细胞计数发现,当叶酸浓度达到50ug/ml及以上时,与其对照组比较,两种细胞系中实验组细胞总数明显降低,且差别有统计学意义(P<0.05);随着叶酸浓度的升高,叶酸对细胞的抑制作用增强。2、p16在宫颈癌细胞中的表达:不同叶酸浓度下,C33A和Caski细胞中,p16mRNA表达间、蛋白表达间差别均有统计学意义(p16mRNA表达:C33A细胞F=2.969,P=0.034;Caski细胞F=3.186,P=0.026;蛋白表达:C33A细胞F=68.821,P<0.001;Caski细胞F=36.674,P<0.001),且随着叶酸浓度的升高,C33A系细胞中p16mRNA表达升高(P=0.006)、蛋白表达降低(P<0.001),Caski细胞中p16mRNA表达降低(P=0.496), p16蛋白表达降低(P<0.001);同一叶酸浓度下,Caski细胞中p16mRNA表达和蛋白表达高于C33A细胞系(P<0.05);3、DNMT1在宫颈癌细胞中的表达不同叶酸浓度下,Caski细胞中各叶酸浓度组中DNMT1mRNA表达间差别、蛋白表达间差别均有统计学意义(DNMT1mRNA表达:F=30.633,P<0.001;蛋白表达:F=32.214,P<0.001),且随叶酸浓度升高,DNMT1mRNA表达和蛋白表达均降低降低(P<0.05);C33A细胞中各组DNMT1蛋白表达间差别有统计学意义(F=73.67,P<0.001),且随叶酸浓度的升高,DNMT1蛋白表达均降低(P<0.05);同一叶酸浓度下,DNMT1mRNA表达和蛋白表达在Caski细胞中高于C33A细胞系(P<0.05);4、Caski细胞中HPV16癌基因E2、E6的表达不同叶酸浓度,E2、E6mRNA表达间差别均无统计学意义(E2:F=3.246,P=0.111;E6:F=2.641,P=0.150)。小结1、叶酸可以抑制宫颈癌细胞Caski和C33A的生长,且随着叶酸浓度的升高,抑制作用增强;同一叶酸浓度下,叶酸对Caski细胞增殖的抑制作用较C33A强,提示叶酸与HPV16感染在宫颈癌细胞中有一定关系。2、叶酸可影响抑癌基因p16mRNA和蛋白在宫颈癌细胞中的表达,补充叶酸可使p16蛋白表达降低,mRNA表达升高;HPV16感染能增加p16高表达的几率。3、叶酸与宫颈癌细胞中DNMT1mRNA和蛋白表达有关,补充叶酸可以使DNMT1mRNA和蛋白表达降低;HPV16感染对DNMT1表达有影响。4、叶酸对Caski细胞中HPV16癌基因的转录水平影响可能较弱。