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子宫内膜异位症（endometriosis,EMT）简称内异症。调查显示子宫内膜异位症患者的生育能力不断下降,子宫内膜异位症患者中大约有50%的女性面临受孕困难的问题。不孕症女性中大约存在25%-50%的子宫内膜异位症患者,其中进行体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embroy transfer,IVF-ET）的子宫内膜异位症不孕患者的种植率和临床妊娠率远远低于输卵管因素而导致不孕的女性患者。目前认为子宫内膜异位症导致不孕的发病机制复杂。子宫内膜异位症可以改变盆腔的生理结构,影响卵母细胞的质量,抑制排卵、受精和胚胎的运送,破坏在位内膜的正常增殖和分化,导致卵巢储备功能的减退,降低子宫内膜的容受性。子宫内膜容受性代表了子宫内膜对胚胎的接受能力。子宫内膜主要是由腺上皮细胞、间质细胞及其周围的细胞外基质（extracellular matrix,ECM）构成。细胞外基质可以给子宫内膜细胞提供空间支架,提供细胞内信号转导途径激活所需的细胞因子及其配体,调节细胞与细胞间的作用。子宫内膜容受性的下降是导致子宫内膜异位症患者不孕的主要原因之一。在胚胎着床过程中,良好的子宫内膜容受性是胚胎成功着床的必备条件。胚胎着床是胚胎植入子宫内膜的过程,需要子宫内膜和胚胎的共同参与,主要包括定位、附着和植入三个步骤。胚胎着床取决于滋养细胞与子宫内膜细胞的对话以及细胞与周围细胞外基质之间的相互作用,其中细胞黏附分子发挥着重要的作用。血小板反应蛋白-1（thrombospondin-1,THBS-1）,是一类具有多种功能的细胞外基质糖蛋白,能够和多种细胞受体发生特异性结合,调控细胞与细胞、细胞与基质之间的作用,影响细胞的生长和凋亡,可以刺激血小板的活性与聚集、调节血管的生成,还可以参与胚胎的发育以及组织的创伤修复,调节肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。胚胎着床的过程与肿瘤细胞侵袭转移的生物学行为相似,已有文献报道THBS-1的分泌随月经呈现周期性的变化,子宫内膜分泌期THBS-1的表达较增殖期升高;复发性流产患者蜕膜组织中THBS-1 m RNA的表达水平比正常早孕女性减少,有研究发现复发性流产患者绒毛和蜕膜组织中THBS-1的表达均下降,这表明THBS-1与正常妊娠的发生有着密切的联系,提示THBS-1可能在胚胎着床时发挥一定作用。目前,有关THBS-1对子宫内膜异位症不孕患者子宫内膜容受性和胚胎着床的影响未见研究报道。目的研究THBS-1在子宫内膜异位症不孕患者在位子宫内膜中的表达,探讨THBS-1对子宫内膜异位症不孕患者子宫内膜容受性和胚胎着床的影响,为改善子宫内膜异位症不孕患者的子宫内膜容受性,提高子宫内膜异位症不孕患者的胚胎种植率和临床妊娠率提供理论依据。材料与方法1、研究对象本研究选取2020年6月至2021年6月在郑州大学第三附属医院妇科因严重子宫内膜异位症或子宫肌瘤行全子宫切除术治疗患者的在位子宫内膜组织,其中3例子宫内膜异位症患者的子宫内膜组织为实验组（EMs组）,3例子宫肌瘤患者的子宫内膜组织为对照组。本研究已通过郑州大学第三附属医院道德伦理委员会讨论批准,所有患者知情同意本研究。实验组患者纳入标准:（1）患者的年龄≤45岁;（2）既往月经周期规律,月经干净3-7天;（3）基础内分泌功能正常,术前三个月无激素使用史;（4）经常规病理诊断为子宫内膜异位症。排除标准:（1）合并其他内分泌相关疾病,如糖尿病等;（2）合并生殖系统疾病,如输卵管炎,盆腔腹膜炎等;（3）合并其他子宫内膜疾病,如子宫内膜炎、子宫内膜息肉等;（4）合并其它恶性疾病。对照组患者纳入标准:（1）与实验组患者的年龄进行匹配,对照组患者的年龄≤45岁;（2）既往月经周期规律,月经干净3-7天;（3）基础内分泌功能正常,术前三个月无激素使用史;（4）经常规病理诊断为子宫肌瘤,子宫内膜正常;（5）无不良孕产史,至少有一次正常足月生育史。排除标准:（1）合并其他内分泌相关疾病,如糖尿病等;（2）合并生殖系统疾病,如输卵管炎,盆腔腹膜炎等;（3）合并子宫内膜疾病,如子宫内膜异位症、粘膜下肌瘤、子宫内膜炎、子宫内膜息肉等;（4）合并其它恶性疾病。2、研究方法第一部分1.收集实验组（EMs组）和对照组患者的在位子宫内膜组织;2.通过实时荧光定量PCR法测定了EMs组和对照组子宫内膜组织中THBS-1的表达;3.进行了两组患者子宫内膜间质细胞与上皮细胞的分离、培养与鉴定;4.通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹（Western Blot）法测定了EMs组和对照组子宫内膜间质细胞中THBS-1的表达;5.复苏、培养人绒毛膜癌细胞球,并诱导两组患者子宫内膜间质细胞蜕膜化,光学显微镜下观察蜕膜化前后细胞形态的变化;6.人绒毛膜癌细胞球与蜕膜化的子宫内膜间质细胞共同培养,48小时后显微镜下观察并计数细胞球的黏附情况;7.统计学分析:本研究主要通过SPSS25软件对实验数据进行统计学处理和分析。统计学数据通常以均数±标准差（（?）±S）表示,两组之间通过t检验进行比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。第二部分1.利用慢病毒载体系统构建THBS-1过表达质粒和空白对照质粒,并转染到子宫内膜异位症不孕患者在位子宫内膜的间质细胞上;2.体外分别诱导内异症在位子宫内膜间质细胞（EE组）、转染过表达THBS-1质粒的内异症在位子宫内膜间质细胞（THBS-1 OE组）和转染空白质粒的内异症在位子宫内膜间质细胞（OE-NC组）蜕膜化;3.通过实时荧光定量PCR和Western Blot法测定EE组、THBS-1 OE组和OENC组蜕膜化标志物泌乳素（prolactin,PRL）和胰岛素生长因子受体1（insulinlike growth factor binding protein-1,IGFBP-1）的表达;4.人绒毛膜癌细胞球与蜕膜化EE组、THBS-1 OE组和OE-NC组子宫内膜间质细胞共同培养48小时,显微镜下观察并计数细胞球黏附情况;5.通过实时荧光定量PCR和Western Blot法测定子宫内膜容受性标志物整合素αvβ3、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）的表达;6.统计学分析:所有数据的统计、整理及分析都使用SPSS25软件完成,所有图片的制作都使用Graph Pad Prism7.0软件完成。统计学数据通常以均数±标准差（（?）±S）表示,三组之间通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验加以比较,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果第一部分1.EMs组和对照组子宫内膜组织中THBS-1的表达实时荧光定量PCR结果表明,EMs组子宫内膜组织中THBS-1 m RNA的表达显著低于对照组,此差异具有统计学意义（P=0.002）。2.子宫内膜间质细胞和上皮细胞的分离、培养与鉴定分离两组患者原代子宫内膜间质细胞进行体外培养,细胞免疫荧光法检测波形蛋白阳性和角蛋白阴性证实原代子宫内膜间质细胞分离培养成功。3.EMs组和对照组子宫内膜间质细胞中THBS-1的表达实时荧光定量PCR结果表明,EMs组子宫内膜间质细胞中THBS-1 m RNA的表达显著低于对照组,差异具有统计学意义（P=0.006）。Western Blot实验结果显示,EMs组子宫内膜间质细胞中THBS-1蛋白的表达远远低于对照组（P=0.001）,与实时荧光定量PCR的实验结果相符。4.人绒毛膜癌细胞球与EMs组和对照组蜕膜化的子宫内膜间质细胞共培养显微镜下观察子宫内膜间质细胞随着蜕膜化的诱导发生形态学变化,细胞逐渐变大变圆。EMs组子宫内膜间质细胞上黏附的人绒毛膜癌细胞球数量为（12.60±2.89）,对照组子宫内膜间质细胞上黏附的人绒毛膜癌细胞球数量为（31.00±5.34）,EMs组子宫内膜间质细胞上黏附的人绒毛膜癌细胞球数量明显少于对照组（P＜0.001）。第二部分1.过表达THBS-1子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞株的构建实时荧光定量PCR实验结果表明,THBS-1 OE组中THBS-1 m RNA表达水平显著高于EE组和OE-NC组（P＜0.001）,而EE组和OE-NC组中THBS-1 m RNA的表达水平无明显差异,与Western Blot实验检测结果相符。2.THBS-1过表达对子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞蜕膜化的影响实时荧光定量PCR实验结果表明,PRL和IGFBP-1 m RNA的表达在EE组、THBS-1 OE组和OE-NC组中随着蜕膜化诱导24h、48h、72h、96h呈现逐渐升高的趋势;同一时间点三组之间PRL、IGFBP-1 m RNA的表达并没有显著的差异,与Western Blot实验检测结果相符。3.THBS-1过表达对子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞黏附的影响THBS-1 OE组细胞上黏附的人绒毛膜癌细胞球数量为（31.20±4.87）,明显多于EE组（15.40±4.34）和OE-NC组（14.20±5.02）,此差异具有统计学差异（P＜0.001）。4.THBS-1过表达对子宫内膜异位症在位子宫内膜间质细胞子宫内膜容受性标志物的影响实时荧光定量PCR实验结果表明,整合素αvβ3、LIF m RNA的表达水平在蜕膜化诱导24h、48h、72h、96h均有逐渐增加的趋势;同一时间点EE组、THBS-1 OE组和OE-NC组中LIF m RNA的表达水平没有显著差异;48h、72h和96h时THBS-1 OE组中整合素αvβ3 m RNA表达水平明显高于EE组和OE-NC组（P＜0.001）,与Western Blot实验检测结果相符。结论1.子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织和间质细胞中THBS-1表达均减少。2.子宫内膜异位症患者在位子宫内膜间质细胞与滋养细胞之间的黏附性下降,可能降低了子宫内膜容受性,从而影响了胚胎着床。3.THBS-1可能通过减少子宫内膜异位症患者在位子宫内膜间质细胞整合素αvβ3的表达,进而影响了滋养细胞的黏附及胚胎着床。