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研究背景天冬酰胺合成酶缺乏征（Asparagine synthetase deficiency,ASNSD）是一种影响神经发育的罕见的遗传代谢病,发病率小于1/1,000,000,2013年由Ruzzo等人首次报道,主要是由天冬酰胺合成酶基因（ASNS）变异引起,婴儿早期死亡率高达71%。ASNSD患者可表现为先天性和进行性小头畸形、严重的全面发育迟缓、痉挛性四肢瘫、进行性脑病、顽固性癫痫等,多在出生后不久发病。ASNS基因位于7号染色体q21区段,主要编码生成天冬酰胺合成酶蛋白（ASNS）。天冬酰胺合成酶可催化天冬氨酸和谷氨酰胺转化生成天冬酰胺和谷氨酸。当ASNS基因突变导致天冬酰胺合成酶生成或功能障碍时,天冬酰胺这种非必需氨基酸可以通过饮食等外源补充,但外源性天冬酰胺不能通过血脑屏障,使得中枢神经的发育出现严重异常。目前,ASNSD疾病的诊断缺乏血液的特异性生化指标,主要依赖基因检测技术进行确诊。本研究在临床上发现来自一个家庭的2名儿童,他们以癫痫、全面发育迟缓和脑萎缩为主要临床特征,拟采用全外显子组测序技术寻找致病基因,通过Sanger测序进行位点验证,并采用CRISPR-Cas9技术构建体外细胞模型,探究致病基因突变对基因表达和蛋白功能的影响。研究目的明确癫痫患者的致病基因,鉴定ASNS基因新突变,拓宽基因突变谱,并揭示突变对于基因表达和蛋白功能的影响。研究方法1.搜集2名癫痫患者的临床基本信息和影像学资料,使用离心柱法提取2名患者外周血全基因组DNA,进行PCR扩增和建库,采用全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）技术并使用Verita Trekker（?）变体检测系统和Enliven（?）变异位点注释解读系统进行致病性变异筛查,根据ACMG指南及HPO、OMIM、Clinvar等公共数据库分析变异,应用Sanger测序验证基因变异位点。采用液相色谱质谱联用技术（Liquid Chromatograph-Mass Spectrometer,LC-MS）检测患儿及其家系成员血浆中天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸水平。2.构建野生型质粒和定点突变质粒,采用CRISPR-Cas9技术,敲入293T细胞得到ASNS定点突变细胞模型,分为实验组（N75S纯合变异组、M538V纯合变异组、N75S+M538V变异组）,阴性对照组（野生型ASNS细胞模型WT OE组、正常293T细胞空白组）,阳性对照组（D138A纯合变异组、N75S+D138A变异组）。采用RT-q PCR和Western blot方法对各组细胞模型的构建进行验证,检测ASNS基因m RNA的表达和标签组蛋白的表达水平,进一步采用LC-MS测定各组细胞中天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的水平。结果1.全外显子组测序结果显示2名癫痫患儿均存在ASNS基因c.224A＞G（p.N75S）和c.1612A＞G（p.M538V）复合杂合变异,Sanger测序结果显示c.224A＞G（p.N75S）来自母亲,c.1612A＞G（p.M538V）来自父亲,其中c.1612A＞G（p.M538V）变异未见报道。2.RT-q PCR实验中,与293T空白组对比,WT OE组、N75S纯合变异组、D138A纯合变异组、N75S+D138A变异组、M538V纯合变异组和N75S+M538V变异组ASNS m RNA表达增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blot实验中,与293T空白组对比,WT OE组、N75S纯合变异组、D138A纯合变异组、N75S+D138A变异组、M538V纯合变异组和N75S+M538V变异组代表ASNS蛋白表达水平的His组蛋白表达水平增加,野生型和定点突变细胞模型构建成功。3.与WT OE阴性对照组相比,M538V纯合变异组ASNS m RNA表达增加,ASNS蛋白表达增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.在ASNS酶活性的定量评价实验中,以生成天冬酰胺的水平作为ASNS蛋白酶活性的间接参考。与WT OE阴性对照组相比,N75S纯合变异组、D138A纯合变异组、N75S+D138A变异组和N75S+M538V变异组生成的天冬酰胺均减少,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;与阳性对照组D138A纯合变异组相比,M538V纯合变异组和N75S纯合变异组生成的天冬酰胺较多,差异有显著统计学意义（P＜0.01）;与阳性对照组N75S+D138A变异组相比,N75S+M538V变异组的生成的天冬酰胺较多,差异有显著统计学意义（P＜0.01）。结论1.ASNS基因c.224A＞G（p.N75S）与c.1612A＞G（p.M538V）形成了复合杂合变异,通过对ASNS基因c.1612A＞G（p.M538V）突变位点的功能实验研究,明确该突变为疑似致病位点,导致天冬酰胺合成酶缺乏征的发生。2.ASNS基因c.1612A＞G（p.M538V）突变对天冬酰胺合成酶活性影响较小,与c.224A＞G（p.N75S）形成的复合杂合变异为非致死性。