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进境苹果检疫性病原真菌引起的苹果病害多具有危害严重、难以防控的特点，通过水果贸易进行异地及跨国传播的风险极大。中国是世界苹果生产大国，一旦这些检疫性病原真菌传入我国，在我国苹果产区扩散、定殖的可能性很大，将对我国苹果生产造成极大危害，所以必须加大口岸检疫力度，严防该类病菌的传入。发展灵敏、准确且高通量的检测技术是防止危险性有害生物入侵、确保货物快速通关的重要保障。
在进境苹果检疫性病害中，苹果牛眼果腐病因近年被我国检疫部门多次截获而得到高度关注。目前，国内对该病的介绍较为零散，更缺乏针对该病四种病原菌所在的明孢盘菌属（Neofabraea）的系统研究。明孢盘菌属中有很多重要的植物病原菌，但由于该属真菌差异不显著且又不稳定的形态鉴别特征造成多个种曾被反复修订，在一定程度上造成了混乱。
随着分子生物学的发展，多种分子技术已应用于植物病原真菌的分类鉴定和快速检测研究。本研究旨在根据进境苹果病原真菌的检疫形势，结合口岸一线检疫工作的实际需求，开发适用于苹果进境口岸检疫的快速检测技术。取得的主要研究结果如下：
（1）明孢盘菌属DNA条形码的初步筛选
对明孢盘菌属的β-tubulin、EF-1α、GPDH、GS、ITS、LSU和SSU等7个DNA条形码备选基因序列进行了筛选，通过扩增效率、测序成功率和物种区分能力的综合考量，初步确定EF-1α基因作为该属真菌DNA条形码的潜力。Barcoding Gap分析显示EF-1α基因比β-tubulin具有更明显的种间和种内遗传变异间隔区。针对EF-1α基因片段设计了一对通用引物（NS1/NS4），有效地解决了其扩增效率低的难题。
（2）构建重要苹果检疫性病原真菌EF-1α基因重组质粒
对 9 种重要苹果检疫性病原真菌，即苹果牛眼果腐病菌 4 个种（Neofabraea malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N. vagabunda）、美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）、苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）、苹果球壳孢腐烂病菌（Sphaeropsis pyriputrescens）、苹果边腐病菌（Phialophora malorum）、苹果黑星病菌（Venturia inaequalis）的EF-1α基因编码区的部分序列（约500 bp）进行克隆，分别将扩增到的目标菌株 EF-1α 基因片段插入 pGEM-T 载体中，构建 pGE-Nm、pGE-Np、pGE-Nv、pGE-Nk、pGE-Mf、pGE-Bs、pGE-Sp、pGE-Pm、pGE-Vi 9种重组阳性质粒，作为基于EF-1α基因构建的分子检测技术的阳性标准物。
（3）构建苹果牛眼果腐病菌基于锁式探针的滚环扩增检测技术
选取苹果牛眼果腐病菌（N.malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N.vagabunda）的EF-1α基因作为检测靶标，根据滚环扩增（RCA）引物及锁式探针（PLP）的设计原则设计了一对通用引物（RCAf/RCAr）和4条具有种特异性的锁式探针（PLP-Nm、PLP-Np、PLP-Nk、PLP-Nv），建立应用RCA快速检测苹果牛眼果腐病菌的方法。
（4）构建苹果牛眼果腐病菌基于TaqMAN探针的实时荧光PCR检测技术
在EF-1α基因序列比对分析的基础上，通过对苹果牛眼果腐病菌（N. malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N.vagabunda）特异位点的分析，根据荧光PCR引物及探针的设计原理设计了一对通用引物（Neo F/Neo R）和 4 条特异性 Taqman 探针（MAL-P、PER-P、KIE-P、VAG-P），建立应用实时荧光 PCR 技术同时检测苹果牛眼果腐病菌4个种的方法。
（5）构建重要苹果检疫性病原真菌的可视芯片检测技术
根据 9 种重要苹果检疫性病原真菌（Neofabraea malicorticis、N. perennans、N. kienholzii、N. vagabunda、Moniliniafructicola、Botryosphaeria stevensii、Sphaeropsis pyriputrescens、Phialophora malorum、Venturia inaequalis）及其近缘种的EF-1α基因序列，设计了一对扩增单链靶标的通用引物（Apl F/Apl R）和9条特异性芯片检测探针（Nm-P、Np-P、Nk-P、Nv-P、Mf-P、Bs-P、Sp-P、Pm-P、Vi-P），构建起进境苹果检疫性病原真菌可视芯片检测技术体系。
本研究从多方面构建针对多种重要苹果检疫性病原真菌的分子检测技术，充分发挥各种检测技术的优势，为进境苹果的病原真菌检疫提供了更多的检测手段，对防止苹果检疫性病原真菌的传入、保护国内农业生产安全将起到积极的作用，同时为进口水果的快速通关奠定了技术基础。
在进境苹果检疫性病害中，苹果牛眼果腐病因近年被我国检疫部门多次截获而得到高度关注。目前，国内对该病的介绍较为零散，更缺乏针对该病四种病原菌所在的明孢盘菌属（Neofabraea）的系统研究。明孢盘菌属中有很多重要的植物病原菌，但由于该属真菌差异不显著且又不稳定的形态鉴别特征造成多个种曾被反复修订，在一定程度上造成了混乱。
随着分子生物学的发展，多种分子技术已应用于植物病原真菌的分类鉴定和快速检测研究。本研究旨在根据进境苹果病原真菌的检疫形势，结合口岸一线检疫工作的实际需求，开发适用于苹果进境口岸检疫的快速检测技术。取得的主要研究结果如下：
（1）明孢盘菌属DNA条形码的初步筛选
对明孢盘菌属的β-tubulin、EF-1α、GPDH、GS、ITS、LSU和SSU等7个DNA条形码备选基因序列进行了筛选，通过扩增效率、测序成功率和物种区分能力的综合考量，初步确定EF-1α基因作为该属真菌DNA条形码的潜力。Barcoding Gap分析显示EF-1α基因比β-tubulin具有更明显的种间和种内遗传变异间隔区。针对EF-1α基因片段设计了一对通用引物（NS1/NS4），有效地解决了其扩增效率低的难题。
（2）构建重要苹果检疫性病原真菌EF-1α基因重组质粒
对 9 种重要苹果检疫性病原真菌，即苹果牛眼果腐病菌 4 个种（Neofabraea malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N. vagabunda）、美澳型核果褐腐病菌（Monilinia fructicola）、苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeria stevensii）、苹果球壳孢腐烂病菌（Sphaeropsis pyriputrescens）、苹果边腐病菌（Phialophora malorum）、苹果黑星病菌（Venturia inaequalis）的EF-1α基因编码区的部分序列（约500 bp）进行克隆，分别将扩增到的目标菌株 EF-1α 基因片段插入 pGEM-T 载体中，构建 pGE-Nm、pGE-Np、pGE-Nv、pGE-Nk、pGE-Mf、pGE-Bs、pGE-Sp、pGE-Pm、pGE-Vi 9种重组阳性质粒，作为基于EF-1α基因构建的分子检测技术的阳性标准物。
（3）构建苹果牛眼果腐病菌基于锁式探针的滚环扩增检测技术
选取苹果牛眼果腐病菌（N.malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N.vagabunda）的EF-1α基因作为检测靶标，根据滚环扩增（RCA）引物及锁式探针（PLP）的设计原则设计了一对通用引物（RCAf/RCAr）和4条具有种特异性的锁式探针（PLP-Nm、PLP-Np、PLP-Nk、PLP-Nv），建立应用RCA快速检测苹果牛眼果腐病菌的方法。
（4）构建苹果牛眼果腐病菌基于TaqMAN探针的实时荧光PCR检测技术
在EF-1α基因序列比对分析的基础上，通过对苹果牛眼果腐病菌（N. malicorticis、N.perennans、N. kienholzii、N.vagabunda）特异位点的分析，根据荧光PCR引物及探针的设计原理设计了一对通用引物（Neo F/Neo R）和 4 条特异性 Taqman 探针（MAL-P、PER-P、KIE-P、VAG-P），建立应用实时荧光 PCR 技术同时检测苹果牛眼果腐病菌4个种的方法。
（5）构建重要苹果检疫性病原真菌的可视芯片检测技术
根据 9 种重要苹果检疫性病原真菌（Neofabraea malicorticis、N. perennans、N. kienholzii、N. vagabunda、Moniliniafructicola、Botryosphaeria stevensii、Sphaeropsis pyriputrescens、Phialophora malorum、Venturia inaequalis）及其近缘种的EF-1α基因序列，设计了一对扩增单链靶标的通用引物（Apl F/Apl R）和9条特异性芯片检测探针（Nm-P、Np-P、Nk-P、Nv-P、Mf-P、Bs-P、Sp-P、Pm-P、Vi-P），构建起进境苹果检疫性病原真菌可视芯片检测技术体系。
本研究从多方面构建针对多种重要苹果检疫性病原真菌的分子检测技术，充分发挥各种检测技术的优势，为进境苹果的病原真菌检疫提供了更多的检测手段，对防止苹果检疫性病原真菌的传入、保护国内农业生产安全将起到积极的作用，同时为进口水果的快速通关奠定了技术基础。