鲟鱼是一类起源早、具有重要科学研究价值和极高经济价值的稀有物种。1998年，世界所有的鲟鱼种类均被列入《濒危野生动植物物种国际贸易公约》附录Ⅱ。为恢复和保护鲟鱼资源，中外学者正不断地对鲟鱼进行各方面的科学研究。精液的超低温冷冻保存技术是一种重要的物种保护手段，具有重要的科研和应用价值，能够有效的保存物种的种质资源、解决雌雄成熟不同步的问题以及保护物种的遗传多样性。为了改良鲟科类精子的超低温冷冻保存技术、健全其精子质量的评价标准，本文主要从以下六个方面进行了相关研究:　　1.渗透性抗冻剂的筛选　　精液超低温冷冻保存技术中最为关键的步骤是稀释液的配制，稀释液由渗透性的抗冻剂和非渗透性的成分组成。在中华鲟精子超低温冷冻保存过程中，对甲醇和二甲基亚砜两种渗透性抗冻剂进行析因实验设计。结果发现:甲醇和二甲基亚砜之间不存在交互作用，10％和20％浓度的甲醇其超低温冷冻保存的效果要显著的高于浓度为1％时，不同浓度的二甲基亚砜(0.5％、5％、10％)对精液的冷冻保存效果上无显著性差异。由于甲醇对细胞的毒性会随着其浓度的升高而增大，我们最终筛选出10％的甲醇作为中华鲟精子超低温冷冻保存稀释液中的渗透性抗冻剂成分。　　2.非渗透性糖类的筛选　　二糖是一种非渗透性的冷冻保护剂。我们研究了非还原性的蔗糖和海藻糖以不同的浓度单独或联合使用在长江鲟精液冷冻稀释液中的效果。结果表明两种非还原性二糖在低浓度下混合使用获得了最佳的冷冻保存效果。然后，我们进一步研究加入了还原性糖后，蔗糖（非还原性）、海藻糖（非还原性）和乳糖（还原性）单独或联合使用在中华鲟、长江鲟、施氏鲟和西伯利亚鲟精液超低温冷冻保存中的效果，并比较了在不同种类的鲟鱼中二糖的使用效果差别。结果表明:在中华鲟和长江鲟中，非还原性且具有特殊保护特性的海藻糖和还原性的乳糖组合使用效果明显更好;在施氏鲟中，乳糖和海藻糖单独或组合使用都能显著提高精子的冷冻保存效果;在西伯利亚鲟中，各处理组间无显著性差异。由此我们发现，海藻糖和乳糖联合使用(15mmol/L海藻糖+15mmol/L乳糖)能够更换掉在鲟鱼精子冷冻保存中通用的蔗糖，是更加适宜于冷冻保存中华鲟和长江鲟精子的方法，该方法同样适用于施氏鲟但不适用于西伯利亚鲟。　　3.GGA对HSP90α的诱导作用及其对冻精质量的影响　　热休克蛋白90是细胞在遭遇刺激时产生的一种蛋白质，其表达水平在许多物种中与精子的质量呈正相关。戊四烯酮(GGA)在许多报道中被证明可以诱导热休克蛋白90的表达。将不同浓度的GGA(0、13.46、67.31、134.61、673.07、1346.13或6730.67μmol/L)添加到中华鲟精液的冷冻稀释液中，研究其对精子冷冻保存效果的影响。结果发现，在GGA浓度低于673.07μmol/L时精子质量随着GGA浓度的增加而升高，但是在GGA浓度大于673.07μmol/L后精子质量随着GGA浓度的增加反而下降。然后，用Westen blot方法检测GGA浓度为0（对照组）、673.07μmol/L（精子质量最好的组）和6730.67μmol/L（GGA浓度最高的组）时冻精中HSP90α的表达水平。结果发现，HSP90α的表达水平在对照组中最低，随着GGA浓度的增加HSP90α的表达水平也会不断升高。综合以上结果，我们发现，GGA能够诱导中华鲟精子中HSP90α表达的增加，并且在GGA浓度小于或等于673.07μmol/L时这种增加可以提升冷冻保存后的精子质量。这项研究给我们提供了一种可行的技术，即在中华鲟精子的超低温冷冻保存中，可通过添加GGA诱导HSP90α的表达来提高冷冻保存后的精子质量。　　4.精子活力、顶体和质膜完整率的检测及其对精子质量的评价作用　　首先，通过实验我们发现，相较于常规显微镜检测、低渗肿胀法和考马斯亮蓝染色法，计算机辅助精子分析系统(CASA)、碘化丙啶(PI)染色法和络合异硫氰荧光素的花生凝集素（FITC-PNA）是更适用于检测中华鲟精子活力、质膜完整率和顶体完整率的方法。然后，在受精率和活力（快速前向运动精子百分比、平均曲线运动速度、平均直线运动速度和平均路径运动速度）、质膜完整率、顶体完整率之间进行Pearson相关分析，结果表明:受精率和它们之间呈显著性正相关(P=0.025、0.001、0.046、0.013、0.046、0.002)。该结果说明快速前向运动精子百分比、平均曲线运动速度、平均直线运动速度、平均路径运动速度、质膜完整率和顶体完整率都可用来评价中华鲟精子的质量。　　5.两种蛋白标志物对精子质量的评价作用　　烯醇化酶3(ENO3)和质膜Ca2+ATPase亚型(PMCA2)是与精子质量相关的蛋白质。将蔗糖、海藻糖和乳糖单独或组合使用在中华鲟精液冷冻稀释液中，得到了六个处理组。通过蛋白质印迹法检测每个处理组中ENO3和PMCA2的表达水平。同时，检测每个处理组中精子的各质量参数。之后，在精子质量参数和蛋白水平之间进行pearson相关分析。结果表明，ENO3的表达水平与质膜完整率呈显著性正相关(P＜0.05)，PMCA2的表达水平与精子运动参数（快速前向运动精子百分比、精子平均曲线运动速度、精子平均直线运动速度、精子平均路径运动速度）呈显著性正相关（P＜0.05）。而且，ENO3和PMCA2表达水平最高的处理组也是精子质量参数最高的组（15mmol/L海藻糖+15mmol/L乳糖）。因此，我们认为，ENO3和PMCA2在中华鲟精子中的表达水平可以作为评价其精子质量的有价值的指标。　　6.建立预测模型评估精子质量并预测受精率　　在精子质量参数中，受精率是精子质量的直接反映，是由多种因素共同作用的结果。因此，设计实验量化了中华鲟精子受精率-Y与其他质量参数（快速前向运动精子百分比-X1、精子平均曲线运动速度-X2、精子平均直线运动速度-X3、精子平均路径运动速度-X4、精子项体完整性百分比-X5和精子质膜完整性百分比-X6）之间的关系，并利用它们之间的关系建立数学模型用以预测受精率（精子质量）。用50个精子样本做主成分回归分析，结果表明，受精率与精子其他质量参数之间的关系可以通过模型方程Y=-23.766+0.150*X1+0.043*X2+0.019*X3+0.029*X4+0.226*X5+0.055*X6来显示。用另外五个精子样本，将检测得到的精子质量参数带入以上模型方程，计算出受精率，并将其与这五个样本实际所得受精率用Pearson相关进行相关性分析，所得相关系数为0.916(P=0.029＜0.05，n=5)，即计算所得受精率和实际受精率之间呈显著性正相关。以上结果表明，所得模型方程可用于准确评估中华鲟精子的质量并预测其受精率。