蛋白质羰基化修饰和内源赤霉素合成对水稻种子萌发的调控

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水稻作为全球重要的粮食作物受到人们的广泛关注,水稻种子的萌发作为水稻生理过程的一个重要环节,对于水稻的繁殖和产量具有决定性作用。因此,阐明水稻种子休眠及萌发的调控机理非常重要。上世纪六十年代水稻半矮高产突变体的发现和绿色革命基因OsGA20ox2的鉴定使得赤霉素(GA)合成的研究成为热点,然而对赤霉素调控水稻种子萌发的分子机理仍有待深入阐述,并将为今后水稻萌发,矮化及高产性状的遗传改良提供指导。  为了进一步揭示赤霉素调控水稻种子萌发的分子机理,本课题通过赤霉素的直接合成和转录调节以及氧化胁迫调节脱落酸(ABA)和赤霉素的平衡三个方面对植物激素GA调控水稻种子的萌发开展了研究。对GA合成和转录调节水稻种子萌发的研究围绕一个水稻种子萌发延迟及半矮突变体进行。主要结果如下:  通过对一个具有稳定遗传性状的EMS诱变获得的水稻萌发延迟及半矮化突变体进行相关表型分析发现:外源赤霉素处理可以恢复突变体种子正常的萌发表型,激素含量测定显示突变体内源赤霉素前体GA53含量显著低于野生型。因此推测该突变体为赤霉素合成缺陷突变体或者赤霉素合成基因的调控因子的突变体。为挖掘相关突变基因,首先构建了突变体与日本晴杂交后代的F2群体以及籼稻9311与突变体的BC1F2群体,两个群体的表型考察确定突变体为隐性纯合子。挑选F2群体中高株和矮株分别建立两个极端表型池,利用全基因组测序技术对两池各60个单株进行测序定位到了六号染色体上两个OsKO基因的稳定突变。OsKO1和OsKO2基因在八号外显子区的连续两个碱基的共同突变造成Thr到Met的转变并且伴随OsKO1和OsKO2在突变体内相对转录水平的升高以弥补其减弱的酶活。在突变体中过表达OsKO1或者OsKO2均能够使突变体表型恢复。其中,OsKO1的恢复作用优于OsKO2。OsKO1在其自身启动子的驱动下可以使突变体的株高恢复正常。由此我们可以肯定突变体的萌发及矮化表型是由于OsKO1和OsKO2的共同突变造成的GA合成突变。OsKO1着重于植株的伸长,OsKO2不仅参与植株的伸长还调控种子的萌发。突变体内源赤霉素含量的降低导致突变体内贮藏蛋白及种子成熟脱水相关蛋白LEAs和淀粉粒的积累从而使突变体的种子休眠延长。  通过酵母单杂交技术及凝胶迁移阻滞实验我们发现了和OsKO2启动子区互作的AN1/A20类型的锌指蛋白OsZF。该基因在萌发过程中的表达量持续下调而在突变体中相对于野生型和外源施加赤霉素的突变体表达上调。它同该基因家族中另外一个负调控赤霉素合成的ZFP185亲缘关系最近。它可能通过对OsKO2的调节直接参与赤霉素合成的调控。  关于水稻种子萌发过程中的蛋白质羰基化修饰,我们通过双向电泳、免疫印迹和MALDI-TOF-MS技术比较了萌发活跃的48 h水稻种子胚和干种子胚中的氧化蛋白质的差异。并利用生物素酰肼标记,亲和层析富集和LC-MS/MS及SWATH分析技术追踪了种子萌发不同阶段0h,24h,48h,72h水稻种子胚羰基化蛋白的动态变化。在双向电泳结果中共鉴定到了96个羰基化蛋白质。在生物素标记样品中共鉴定到了228个羰基化肽段对应于144个羰基化蛋白。在种子萌发过程中伴随着ROS的积累,羰基化蛋白的增多和赤霉素含量的升高,从而促进贮藏蛋白的水解打破休眠促进萌发,结构蛋白的水解重建植株形态以及抗氧化蛋白维持氧化还原动态平衡。而在种子成熟脱水过程中则伴随着ABA和贮藏蛋白的积累以维持种子的休眠。但是在成熟种子胚中仍存在氧化还原的动态平衡和蛋白的氧化。  本研究表明OsKO1和OsKO2基因通过直接调控GA的合成水平对水稻的株高和种子的正常萌发进行调节。AN1/A20类型的锌指蛋白OsZF通过和OsKO2基因的启动子区上游核心元件结合也直接参与GA的合成水平的调节。羰基化修饰的蛋白通过调节萌发的水稻种子的氧化还原状态和贮藏及结构蛋白的降解促进水稻种子的萌发。这些发现对于深入揭示水稻种子萌发调控的分子与代谢机理,指导水稻生产均具重要的价值。
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