目的研究高浓度碘对金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ敲除小鼠(Metallothionein Ⅰ/Ⅱ Knockout mice, MT-Ⅰ/Ⅱ KO mice)甲状腺线粒体氧化应激—抗氧化防御的影响,探讨在有和没有MT-Ⅰ/Ⅱ的情况下,高浓度碘对小鼠甲状腺细胞氧化应激—抗氧化防御的机制,并用碘转运的竞争抑制剂过氯酸盐(KCIO4),促甲状腺激素(thyrotropin, TSH), TPO的抑制剂(抗甲状腺药丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil, PTU)进行干预,研究高浓度碘对MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺线粒体氧化应激—抗氧化防御的影响。方法在细胞水平1.制备同源对照小鼠(Wild type mice, WT mice)及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺细胞悬液,分别给予10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-mol/L H2O2处理2h,①利用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法检测细胞活力。②利用MitoSOX通过流式细胞术检测甲状腺细胞线粒体超氧化物生成。③利用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒检测细胞培养液上清的LDH漏出率。④利用Western blot免疫印迹法检测Prx3蛋白水平表达的变化。2.用10-mol/L KI加或不加30μmol/L KClO4处理2h,检测WT小鼠及MT Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺细胞线粒体超氧化物生成、细胞活力、LDH漏出率。3.用10-4mol/L KI加或不加300μmol/L PTU处理2h,检测WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺细胞线粒体超氧化物生成、细胞活力、LDH漏出率。4.用10-4mol/L KI加或不加10U/L TSH处理2h,检测WT小鼠及MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺细胞活力、LDH漏出率。在动物水平建立短期碘过量的动物模型,①适碘组(NI)②10倍碘过量组(10HI)③100倍碘过量组(100HI),喂养14天后开始实验。1.采用过硫酸铵消化砷铈催化分光光度法测定尿碘含量。2.计算甲状腺脏体比。3.HE染色观察甲状腺形态学变化。4.甲状腺激素水平的测定。5.通过MTT法检测细胞活力。6.利用LDH检测细胞培养液上清的LDH漏出率。7.利用MitoSOX通过流式细胞术检测甲状腺细胞线粒体超氧化物生成。8.利用Western blot免疫印迹法检测Prx3蛋白水平表达的变化。结果在细胞水平1.无论WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,10-4mol/L、10-3mol/L、10-2mol/L的KI和10-3mol/LH2O2可诱导小鼠甲状腺细胞活力下降(P<0.01),LDH漏出率增加(P<0.01),线粒体超氧化物生成增多(P<0.01)；流式细胞术分析显示MT-Ⅰ/Ⅱ KO较WT小鼠的线粒体超氧化物生成增加更明显(P<0.01)。随着KI浓度的增加,明显增加了小鼠甲状腺Prx3的表达水平(P<0.05),且WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间有差异(P<0.05)。2. PTU、KClO4和TSH抑制高浓度碘诱导的MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠甲状腺相对细胞活力的下降、LDH漏出率的增加、线粒体超氧化物生成的增加。①无论WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,KI (100μM)可诱导小鼠甲状腺细胞的相对活力显著下降。加入PTU (300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH (10U/L)处理后,较单纯KI(100μM)处理组,细胞活力显著升高(P<0.01)。与WT小鼠相比,MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠细胞活力降低更加明显(P<0.01)。②无论WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,PTU(300μM)、KClO4(30μM)和TSH(10U/L)可显著抑制KI(100μM)诱导的线粒体超氧化物生成增多(P<0.01)。WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间相比,各种处理下MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠线粒体超氧化物生成升高更加明显(P<0.05)。③无论WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,KI (100μM)可诱导小鼠甲状腺细胞LDH漏出率显著增加。加入PTU(300μM)或KClO4(30μM)亦或者TSH(10U/L)处理后,较单纯KI(100μM)处理组,LDH漏出率显著降低(P<0.01)。与WT小鼠相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠LDH漏出率增加更加明显(P<0.01)。在动物水平1.小鼠在喂养到14天时,无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,3组尿碘水平随摄入量增加依次成倍升高(p<0.05),与WT小鼠比较,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠尿碘浓度更高(p<0.05)。2.小鼠在喂养到14天时,脏体比显示无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,NI组与100HI组之间有一定差异(p<0.05),NI组与10HI组之间无明显差异。3.无论在WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,10HI组和100HI组与NI组比较,血清甲状腺激素T3、T4、FT3、FT4水平变化均没有显著性差异(P>0.05),与WT小鼠比较,在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠,100HI组血清FT4水平显著升高(P<0.05)。4.在镜下观察,在MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠和小鼠中,NI组和10HI甲状腺多为中等大小滤泡,100HI组甲状腺与NI组比较,表现为：有明显的炎症浸润,既有部分滤泡明显增大,部分滤泡接近正常略有增生；也有部分滤泡变小,滤泡腔变小,在WT小鼠中,表现更明显。5.无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,100HI组与NI组相比,细胞活力均明显降低(p<0.01),但WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠细胞活力降低更明显(p<0.01),NI组与10HI组之间无明显差异。6.无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,100HI组与NI组相比,细胞损伤均明显升高(p<0.01),但WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠细胞损伤升高更明显(p<0.01),NI组与10HI组之间无明显差异。7.无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,100HI组与NI组相比,线粒体超氧化物生成均明显升高(p<0.01),但WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠线粒体超氧化物生成升高更明显(p<0.05),NI组与10HI组之间无明显差异。8.无论在WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠中,100HI组与NI组相比,Prx3表达水平均升高(p<0.05),但WT与MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠之间相比,MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠Prx3表达水平升高更明显(p<0.05),NI组与10HI组之间无明显差异。结论1.金属硫蛋白Ⅰ/Ⅱ在高浓度碘诱导的甲状腺氧化应激和抗氧化防御中具有一定的保护作用。2.在MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠,高浓度碘均可诱导甲状腺细胞线粒体超氧化物生成增加。3.PTU (300μmol/L)可以减轻高浓度碘诱导的MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠甲状腺细胞的氧化应激。4.KClO4(30μmol/L)可以减轻高浓度碘诱导的MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠甲状腺细胞的氧化应激。5.TSH (10U/L)可以减轻高浓度碘诱导的MT-Ⅰ/Ⅱ KO和WT小鼠甲状腺细胞的氧化应激。6.碘过量可导致甲状腺功能减退,且随着碘摄入量的变化而改变。