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研究表明,辐照致弱血吸虫疫苗能够诱生高保护性免疫效果,其机制可能是通过辐照致弱血吸虫来源的分子刺激宿主免疫细胞在肺部形成了以Th1为主的致炎性环境而实现的。因此,发现和鉴定这些保护性分子并阐明其免疫生物学功能,对研发高效安全的抗血吸虫分子疫苗具有重要的指导意义。本文旨在研究日本血吸虫钙网质蛋白(SchistosomajaponicumCalreticulin,SjCRT)在先天性免疫应答和获得性免疫应答中的作用和功能,以期为阐明辐照致弱血吸虫疫苗的保护机制提供依据。1、SjCRT在不同期别正常及辐照致弱童虫上的表达。体外培养不同期别的辐照和正常童虫,用胰酶消化成单个细胞。流式细胞术检测结果显示,体外培养4 d时SjCRT在辐照组虫体细胞内的表达量明显高于正常组(P<0.05);而7 d、10 d和14 d时,SjCRT在辐照组虫体细胞内的表达量明显低于正常组(P<0.05)。RT-PCR检测SjCRT转录水平变化,发现辐照组在7 d显著高于正常组(P<0.05),在10 d时两组无显著差异。初步推断在辐照早期4 d时SjCRT在虫体细胞内呈现高表达,随着体外培养时间推移,SjCRT释放到细胞外。2、SjCRT活化宿主巨噬细胞的初步研究。SjCRT与RAW264.7细胞共孵育72 h,通过MTT检测细胞增殖情况、Griess法检测胞外NO含量、RT-PCR法检测巨噬细胞上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达、ELISA检测胞外细胞因子、流式细胞术检测细胞表面分子。MTT结果显示,SjCRT能够显著促进巨噬细胞增殖(P<0.05);RT-PCR结果显示SjCRT促进巨噬细胞上调表达COX-2、cPLA2、CCR7、TNF-α和IL-1βmRNA;Griess法结果提示,SjCRT能够促进巨噬细胞分泌NO(P<0.01);ELISA结果表明SjCRT能够极其显著地促进巨噬细胞分泌TNF-α(P<0.01);流式细胞术表明,未经处理的巨噬细胞能表达一定水平的CCR7,但SjCRT的刺激能使巨噬细胞表面趋化因子受体CCR7的表达水平极显著地增加(P<0.05)。提示SjCRT可以活化巨噬细胞。3、探究SjCRT活化宿主DC的机制。通过激光共聚焦和流式细胞术研究SjCRT与DC的结合情况、RT-PCR检测DC上几种细胞因子和趋化因子转录水平的表达情况、ELISA检测DC培养上清中细胞因子表达情况、流式细胞术检测DC表面CCR7和CXCR4表达情况、CFSE法检测CD4+T细胞增殖、ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况。结果:SjCRT可以结合在DC表面,它能够与DC表面的CD91受体结合进而被介导内吞;RT-PCR结果显示与未刺激相比,SjCRT的刺激可以促进DC极其显著地上调TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、CXCL-2、CCR7和CXCR4这几种细胞因子和趋化因子的mRNA的表达(P<0.01);SjCRT的刺激也能促进DC极其显著的表达并分泌TNF-α、IFN-γ和IL-4,并且差异极其显著(P<0.01);流式结果显示SjCRT的刺激能使细胞表面趋化因子受体CCR7和CXCR4的表达水平极显著地增加(P<0.01);CFSE法表明SjCRT刺激组有明显的增殖现象,增殖细胞百分比分别为47.7%和44.1%;ELISA检测CD4+T细胞胞外细胞因子分泌情况,显示SjCRT刺激48h后的DC能够促进T细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-4和IL-10,并且与对照组相比差异极显著(P<0.01)。结果提示:SjCRT能够促进DC功能成熟。4、SjCRT诱导致敏小鼠混合淋巴细胞反应。SjCRT刺激致敏小鼠淋巴细胞48 h后,MTT法检测淋巴细胞增殖、流式细胞术检测淋巴细胞亚群状况以及胞内细胞因子的表达情况。结果显示该蛋白能够显著地刺激致敏小鼠淋巴细胞增殖(SI>2);蛋白免疫组CD4+/CD8+T细胞的比值为2.26显著高于对照组的1.76(P<0.01),且胞内IFN-γ的表达量显著增加(P<0.05)。提示SjCRT可以诱导小鼠产生Th1型免疫应答反应。综上所述,本研究发现SjCRT在辐照童虫早期能够大量表达并释放到细胞外。SjCRT可以活化巨噬细胞、通过CD91受体介导进入DC促进DC功能成熟并且能够活化CD4+T细胞并诱导其向Th1型分化。为DC进一步诱导抗原特异性的CD4+T细胞的分化(极化)提供了基础,也为为进一步阐明SjCRT在辐照致弱血吸虫疫苗模型中所发挥的作用和机制奠定了基础。