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伊氏锥虫（Trypanosoma evansi,T.evansi）是一种寄生于血液中的原虫,可感染多种动物引起伊氏锥虫病,又称苏拉病。伊氏锥虫感染不同动物后表现出不同的临床症状,引起马属动物和犬的急性感染,主要表现为高热、体重减轻、贫血、生殖器官炎症和神经系统症状,并最终导致死亡;感染牛和水牛后会导致慢性感染,表现为消瘦、厌食、贫血和生产力下降,给养殖业造成了巨大的经济损失。已经报道了几起人伊氏锥虫感染。目前,治疗伊氏锥虫病主要使用三氮脒等化学药物,尚无有效的疫苗来预防该病。已报道伊氏锥虫通过抗原变异、体表结合宿主的纤溶酶和诱导淋巴细胞死亡等方式逃避宿主免疫,深入研究伊氏锥虫免疫逃避机制将有助于我们探索伊氏锥虫病防控新策略。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）作为一种重要的模式识别受体,可识别病原体相关分子模式来激活机体的天然免疫应答。新孢子虫、弓形虫、利什曼原虫和疟原虫等寄生虫都可以被TLRs识别,诱导机体发生保护性、调节性或致病性反应。然而,TLRs在伊氏锥虫感染中的作用及机制仍鲜有报道。胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）是由细胞释放的具有膜结构的小泡,在细胞之间进行信息传递。已报道布氏锥虫通过EVs将可变表面糖蛋白转移到宿主红细胞内,造成宿主贫血;还可以将血清抗性相关蛋白传递给不含有该蛋白的锥虫。伊氏锥虫是否可以分泌胞外囊泡,以及胞外囊泡在伊氏锥虫致病过程中的作用及机制尚未见报道。因此,本研究针对伊氏锥虫免疫逃避机制尚不清楚的问题,从TLRs信号通路和胞外囊泡角度,对TLRs通路在伊氏锥虫感染中的作用、伊氏锥虫胞外囊泡分离鉴定和蛋白质组学分析、伊氏锥虫胞外囊泡及组分在虫体与宿主细胞信息传递和伊氏锥虫致病中的作用和分子机制进行深入研究。主要内容如下:1、伊氏锥虫激活TLR2通路及TLR2与伊氏锥虫致病的关系。（1）参与识别伊氏锥虫TLRs的筛选。将伊氏锥虫作用小鼠骨髓源巨噬细胞（mouse bone marrow-derived macrophage,BMDM）,荧光定量PCR检测TLRs表达情况。结果表明伊氏锥虫可上调BMDMs TLR2、TLR3和TLR4的表达。（2）TLRs在伊氏锥虫感染中的作用。伊氏锥虫感染野生型（wild-type,WT）和TLR2-/-、TLR3-/-和TLR4-/-小鼠后,检测小鼠外周血中虫体数量、存活时间、血清中IL-12p40和IFN-γ的分泌情况以及病理变化观察。结果表明,与WT小鼠相比,TLR2-/-小鼠感染伊氏锥虫后其存活时间延长、血液中虫体数量较少、血清中IL-12和IFN-γ的分泌水平较高,表现较轻微的伊氏锥虫病;而TLR3-/-和TLR4-/-小鼠各指标与WT小鼠相较无显著差异。（3）伊氏锥虫激活TLR2信号通路及对细胞因子分泌影响。将伊氏锥虫作用WT和TLR2-/-小鼠BMDMs,Western blot检测TLR2、ERK和AKT信号通路,ELISA检测炎性细胞因子分泌。结果表明,伊氏锥虫可以激活小鼠BMDMs的TLR2-AKT信号通路,抑制IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌。（4）AKT途径在伊氏锥虫感染中的作用。用AKT抑制剂MK-2206进行动物试验,检测小鼠外周血寄生虫数量、存活时间、血清中IL-12p40和IFN-γ的分泌情况。结果表明,AKT抑制组的小鼠存活时间延长、血液中虫体数量较少、血清中IL-12p40和IFN-γ的分泌水平较高,表现较轻微的伊氏锥虫病。2、伊氏锥虫胞外囊泡在激活TLR2通路和伊氏锥虫感染中的作用。（1）伊氏锥虫胞外囊泡（Te EVs）的分离鉴定。通过差速超速离心法分离伊氏锥虫胞外囊泡,用透射电镜和扫描电镜观察以及粒径分析等方法对Te EVs进行鉴定。成功分离到具有双层膜结构、呈典型半球状的Te EVs,平均直径为110±22.12 nm。扫描电镜和超薄切片结果显示,伊氏锥虫可通过纳米管逐步解离的形式释放EVs,Te EVs的膜与伊氏锥虫的质膜类似。用Di O标记的Te EVs刺激BMDMs后经激光共聚焦观察发现Te EVs被内化到BMDMs胞质内。（2）Te EVs激活BMDMs的TLR2信号通路及对细胞因子分泌的影响。将Te EVs作用WT和TLR2-/-小鼠BMDMs,Western blot检测TLR2、ERK和AKT信号通路,ELISA检测炎性细胞因子分泌。结果表明,Te EVs可以通过激活TLR2-AKT信号通路抑制IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌。（3）Te EVs在伊氏锥虫感染中的作用。Te EVs经尾静脉注射小鼠后感染伊氏锥虫,检测小鼠外周血中寄生虫数量、存活时间、血清中IL-12p40和IFN-γ的分泌情况。结果表明Te EVs抑制IL-12p40和IFN-γ的分泌,增加血液中虫体数量,缩短小鼠存活时间。3、伊氏锥虫胞外囊泡组分—动基体膜蛋白11对虫体感染的影响。（1）Te EVs的蛋白质组学分析。Te EVs中鉴定出746种蛋白质,其中至少有一种独特肽段的蛋白质占57.5%,选择热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP-70）、延伸因子-1α（translation elongation factor-1α,EF-1α）、醛缩酶（Aldolase）和动基体膜蛋白11（kinetoplastid membrane protein 11,KMP-11）验证蛋白质组学结果。KEGG结果分析表明胞外囊泡中595种蛋白质参与了78条信号通路,包括PI3K-AKT、MAPK、NOD-like和Toll-like等信号通路。通过免疫荧光试验发现将Te EVs与BMDMs共孵育后Te KMP-11定位于BMDMs细胞质中,表明Te EVs可以将所携带的蛋白质运送到宿主细胞内。（2）r Te KMP-11激活BMDMs信号通路及对细胞因子分泌的调控。将r Te KMP-11作用WT小鼠BMDMs,Western blot检测MAPK和AKT信号通路的激活情况,ELISA检测炎性细胞因子分泌情况。结果表明r Te KMP-11可以通过激活AKT信号通路抑制IL-12p40、IL-6和TNF-α的分泌。（3）Te KMP-11在伊氏锥虫感染中的作用。用脂质体包裹的r Te KMP-11经尾静脉注射伊氏锥虫感染的小鼠后,检测小鼠外周血中寄生虫数量、存活时间、血清中IL-12p40和IFN-γ分泌。结果表明r Te KMP-11可以抑制IL-12p40和IFN-γ的分泌,缩短伊氏锥虫感染小鼠存活时间和增加虫体数量,加速感染小鼠的疾病进程。综上所述,本研究揭示伊氏锥虫通过激活TLR2-AKT信号通路抑制IL-12p40和IFN-γ分泌的免疫逃避机制。首次分离鉴定伊氏锥虫胞外囊泡并获得Te EVs蛋白质组学数据。确定伊氏锥虫胞外囊泡及其组分Te KMP-11参与伊氏锥虫免疫逃避过程。本研究首次从TLR2和胞外囊泡角度解析了伊氏锥虫免疫逃避机制,为伊氏锥虫病的防治提供新的理论依据。