论文部分内容阅读
随着我国卷烟和烟叶市场国际化程度的逐步加深，对卷烟的安全性的要求不断提高。近年来，利用微生物和生物酶降低烟草危害、提高烟叶品质的研究日益受到研究人员的重视。为探索微生物和生物酶改善烟叶品质的可行性，本文进行了以下两个方面的研究工作：1.降烟碱细菌的分离、鉴定和烟碱代谢特性的研究；2.醇化烟叶生物酶的提取、检测和烟叶储存条件对生物酶活性的影响。
主要实验结果如下：
1.降烟碱细菌的分离、鉴定和烟碱代谢特性的研究(1)降烟碱细菌的分离和纯化从40份土样中分离得到9株降解烟碱的菌株，对这些菌株的降烟碱能力进行重复实验表明，取自云南烟草研究院的N22菌株表现出较为稳定和高效的降烟碱能力。因此，本研究选择以N22菌株为出发菌株。
(2)降烟碱细菌N22菌株的鉴定根据N22菌株的生理生化性质分析结果，降烟碱细菌N22菌株和假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的生理生化性质相近。同时16S rDNA序列的聚类分析结果表明，N22菌株的16S rDNA序列和假单胞菌属细菌的相似度最高，因此，N22菌株被鉴定为假单胞菌N22(．Pseudomonas sp．N22)。
(3)Pseudomonas six N22菌株发酵条件优化N22菌株降解烟碱的能力受到多种因素的影响，添加适量的精制淀粉和(NH4)2SO4作为外加碳氮源可明显促进烟碱的降解，N22菌株适宜的培养温度、pH和时间分别为30℃、pH6.0～7.0和9h。
(4)Pseudomonas sP. N22菌株对烟碱的降解特性分析采用N22菌株所产酶液对上部烟叶进行处理，卷烟评吸结果表明：经酶液处理后的上部烟叶，劲头分散，刺激性减轻明显，抽吸品质显著提高。Pseudomonassp.N22菌株不仅能降解纯烟碱，也能够降解烟叶水提物中的烟碱。烟碱代谢产物的GC-MS分析结果表明：N22菌株以烟碱作为唯一碳氮源发酵了24h后，大部分烟碱(96.5％)被降解，但是一些微量的有害代谢产物如米喔斯明和可的宁等也被发现。然而，在发酵了60h后，烟碱几乎完全被降解，降解率到达99．9％，同时那些有毒害的中间代谢产物也被完全降解。此外，Pseudomonas sp.N22菌株在48h内能够完全降解烟叶水提物中的烟碱。 2.醇化烟叶生物酶的提取、检测和烟叶储存条件对生物酶活性的影响
(1)醇化烟叶生物酶的提取和条件优化将烟草浸提液分别用10％～70％的不同浓度的酒精沉淀法和56％的硫酸铵沉淀法来提取粗酶液。根据最终测定的酶活结果，我们确定用20％的酒精沉淀法作为本部分实验中粗酶液的提取方法。
(2)醇化烟叶生物酶的变化规律醇化烟叶生物酶活性检测结果表明：除了2006年蛋白酶活性下部烟叶(X3F)比上部烟叶(B4F)高以外，其它的样品都遵循一个规律：中部烟叶(C3F)和下部烟叶(X3F)的蛋白酶和纤维素酶活性比上部烟叶(B4F)高，而上部烟叶(B4F)中的淀粉酶活性和蔗糖酶活性高于中部烟叶(C3F)和下部烟叶(X3F)。
同时，不同部位的烟叶样品(上部、中部和下部)蛋白酶、淀粉酶和蔗糖酶的活性变化幅度较小，而纤维素酶的活性变化幅度较大(7.433U~19.472U)，中部和下部烟叶样品的纤维素酶活性较高，但上部烟叶样品的纤维素酶活性则相对较低。上部和中部烟叶样品中的生物酶活性2005年最高，2006年的生物酶活性较低。
(3)储存条件对烟叶生物酶活性的影响在不同储存条件下的烟丝样品分析结果为：烟丝含水率在12.67％～24％范围内，烟丝含水率越低，烟丝内源生物酶酶活越大；在烟丝含水率21％，温度50℃条件下，储放3～4h，烟丝内源生物酶酶活都能达到一个最高值。延长储放时间其酶活的变化波动不大。烟丝储放最佳温度为30℃～50℃，因为这时烟丝内源生物酶酶活最大。
本论文的创新性主要体现在以下方面：
i筛选得到具有较高降解烟碱能力的菌株，能够降解纯烟碱和烟叶中的烟碱，并使烟叶品质得到改善，突破了传统的农田间的管理和化学途径降解烟碱的方法，为生化技术应用到烟草品质改良提供了基础。．
ii将传统的酶活检测方法经过改进，可以快速检测烟叶中的生物酶活性。