论文部分内容阅读
无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是常见的人兽鱼共患病原菌，自2007年以来，该菌每年都在我国广东、海南、福建、广西等罗非鱼主要养殖区暴发流行，造成巨大经济损失，严重威胁着我国罗非鱼产业链的健康发展。到目前为止，对罗非鱼无乳链球菌病的治疗效果欠佳，且未有可大面积推广的有效疫苗。本研究以无乳链球菌C抗原α蛋白(编码基因bca)为研究对象，通过对α蛋白的生物信息学分析，以bca基因N端保守区，分别构建了亚单位疫苗和核酸疫苗，并用构建的疫苗免疫罗非鱼，评估了疫苗的免疫效果。主要研究内容如下: 1.鱼源无乳链球菌bca基因的克隆表达以及生物信息学分析 克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0101分离株的bca基因，通过生物信息学软件对其序列进行了分析，结果显示:bca基因的ORF由1341个碱基组成，编码一个长度为446个氨基酸的多肽，N-端具有一个保守的YSIRK信号肽序列和一个AlphaC_N超家族结构域，C-末端含有1个保守Gram_pos_anchor超家族结构域，而在中间具有2个重复的Rib结构域;比较不同来源分离株的α蛋白结构，发现主要区别在于Rib结构域重复数目的不同;同源性及系统进化树分析，发现本株菌的α蛋白与已报道的人源A909和鱼源GD201008-001α蛋白聚为一簇，同源性达100％;推测该蛋白为亲水性蛋白，存在一个跨膜区，有37个潜在的磷酸化位点和1个潜在的N-糖基化位点;二级结构分析发现存在较多的无规则卷曲，推测有12个氨基酸区域可能是B细胞抗原表位;当选择大肠杆菌BL21为表达宿主时，该重组蛋白的溶解度高达100％，亚细胞定位显示该蛋白位于细胞壁上。 2.无乳链球菌pbca基因重组表达质粒的构建及免疫原性分析 根据对bca基因生物信息学分析结果，去掉跨膜区和革兰氏阳性菌锚定区域，选取表达部位51-401AA区间设计特异性引物进行PCR扩增，扩增片段经胶回收后克隆至pMD19-T载体，鉴定正确后用BamHⅠ和XhoⅠ将目的片段从克隆质粒上切出，并连接至表达载体pET-32a(+)，得到重组表达质粒pET-32a(+)-pbca;将重组表达质粒经鉴定正确后转入BL21(DE3)，然后对重组表达宿主菌的诱导温度、IPTG浓度和诱导时间进行优化;在最优条件下大量诱导表达重组蛋白，然后以纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清，用琼扩试验检测抗体效价，并运用western-blot检测抗体与重组蛋白的免疫原性。结果显示:最佳表达条件为温度37℃，IPTG浓度为0.1mmol/L，诱导时间为4h;琼脂糖扩散试验显示制备的兔抗pBCA血清的抗体效价为1∶32;western-blot分析结果表明制备的血清能够与重组蛋白进行特异性结合。 3.无乳链球菌pbca基因重组亚单位疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 将制备的重组pBCA，分别以pBCA组、pBCA佐剂组和PBS对照组腹腔注射免疫健康罗非鱼，分别在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法检测免疫抗体，结果显示pBCA组和pBCA佐剂组均能诱导鱼体产生抗体，并且pBCA组在第四周抗体水平达到最高，pBCA佐剂组在第五周抗体水平达到最高。pBCA组和pBCA佐剂组与PBS对照组在第二周开始，抗体水平差异极显著(P＜0.01);溶菌酶活性分析发现，从免疫后第一周到第六周，pBCA组和pBCA佐剂组溶菌酶活力均极显著高于PBS对照组(p＜0.01)，并且从第二周到第六周，pBCA组和pBCA佐剂组溶菌酶活力均维持较高水平，pBCA组在第四周达到最高峰，pBCA佐剂组在第五周得到最高峰;对罗非鱼的IL-1β和TNF-a基因在组织中转录分析发现，IL-1β和TNF-α基因在免疫组中，在脾脏和头肾都有极显著的转录水平上调，且在脾脏中的转录水平高于在头肾中的转录水平。攻毒试验结果显示，pBCA佐剂组和pBCA组的相对保护率分别为66.67％和52.38％。以上结果表明重组pBCA具有较好的免疫保护作用，可以作为候选疫苗之一。 4.无乳链球菌pbca基因核酸疫苗的构建 将pbca基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-pbca，然后通过菌落PCR以及双酶切进行pbca基因的鉴定。鉴定正确后，将构建的真核重组质粒pcDNA3.1(+)-pbca的阳性克隆分别接种于2L LB液体培养基中，扩大培养，提取质粒。提取的重组质粒pcDNA3.1(+)-pbca经电泳检测，条带大小约7200bp，与预计的大小一致，经分析pcDNA3.1(+)-pbca浓度为1.4mg/L，0D268/280＞1.8，质粒纯度较高可以作为核酸疫苗使用。 5.无乳链球菌pbca基因核酸疫苗对罗非鱼免疫效果的研究 将制备好的重组质粒以肌肉注射的方式免疫罗非鱼，分为DNA重组质粒组、空质粒组和PBS对照组，免疫后第7d、14d、21d采集肌肉组织，提取总RNA，RT-PCR扩增以确定疫苗注射后目的基因表达情况。结果表明DNA重组质粒疫苗组的三个时间点样品均扩增出目的基因，而空质粒组和PBS对照组未扩增出目的基因，证明重组表达质粒在鱼体内得到成功转录，构建的核酸疫苗获得成功。分别在免疫后第7d、14d、21d、28d、35d、42d采集血清，用建立的ELISA方法检测免疫抗体，结果显示重组质粒能诱导鱼体产生特异性抗体，到第四周时，抗体水平达到最高峰，第五周和第六周都维持较高水平。溶菌酶活性分析发现，从免疫后第一周到第六周，DNA疫苗组溶菌酶活力均极显著高于PBS对照组(p＜0.01)，并且从第三周到第六周，DNA疫苗组溶菌酶活力均维持较高水平，在第五周达到最高峰。对罗非鱼的IL-1β和TNF-α基因在组织中转录分析发现，IL-1β和TNF-α基因转录水平在DNA免疫组鱼的脾脏和头肾中极显著的上调，且脾脏中的转录水平高于头肾中的转录水平;攻毒试验结果显示，DNA疫苗组的相对保护率为47.62％，以上结果表明以pbca基因构建的DNA疫苗具有较好的免疫保护作用，可以作为候选疫苗之一。